1 范围

本标准规定了食品中产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）的检验方法。

本标准适用于食品中产气荚膜梭菌的检验。

2 设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

a） 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃；

b） 冰箱：2 ℃～5℃；

c） 恒温水浴箱：50℃±1 ℃，46℃±0.5℃；

d） 天平：感量0.1 g；

e） 均质器；

f） 显微镜：10×～100×；

g） 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头；

h） 无菌试管：18mm×180mm；

i） 无菌培养皿：直径90 mm；

j） pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸；

k） 厌氧培养装置。

3 培养基和试剂

3.1 胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸（TSC）琼脂：见附录A 中A.1。

3.2 液体硫乙醇酸盐培养基（FTG）：见附录A 中A.2。

3.3 缓冲动力-硝酸盐培养基：见附录A 中A.3。

3.4 乳糖-明胶培养基：见附录A 中A.4。

3.5 含铁牛乳培养基：见附录A 中A.5。

3.6 0.1%蛋白胨水：见附录A 中A.6。

3.7 革兰氏染色液：见附录A 中A.7。

3.8 硝酸盐还原试剂：见附录A 中A.8。

3.9 缓冲甘油-氯化钠溶液：见附录A 中A.9。

4 检验程序

产气荚膜梭菌检验程序见图1。

5 操作步骤

5.1 样品制备

5.1.1 样品采集后应尽快检验，若不能及时检验，可在2 ℃～5 ℃保存；如8 h 内不能进行检验，应以

无菌操作称取25 g（mL）样品加入等量缓冲甘油-氯化钠溶液（液体样品应加双料），并尽快至于-60 ℃

低温冰箱中冷冻保存或加干冰保存。

5.1.2 以无菌操作称取25 g（mL）样品放入含有225 mL 0.1%蛋白胨水（如为5.1.1 中冷冻保存样品，

室温解冻后，加入200 mL 0.1%蛋白胨水）的均质袋中，在拍击式均质器上连续均质1 min～2 min；或

置于盛有225 mL0.1%蛋白胨水的均质杯中，8 000 r/min～10 000 r/min 均质1min～2 min，作为1:10 稀释

液。

5.1.3 以上述1:10 稀释液按1 mL 加0.1%蛋白胨水9 mL 制备10-2～10-6 的系列稀释液。

5.2 培养

5.2.1 吸取各稀释液1 mL 加入无菌平皿内，每个稀释度做两个平行。每个平皿倾注冷却至50 ℃的TSC

琼脂（可放置于50 ℃±1 ℃恒温水浴箱中保温）15 mL，缓慢旋转平皿，使稀释液和琼脂充分混匀。

5.2.2 上述琼脂平板凝固后，再加10 mL 冷却至50 ℃的TSC 琼脂（可放置于50 ℃±1 ℃恒温水浴箱

中保温）均匀覆盖平板表层。

5.2.3 待琼脂凝固后，正置于厌氧培养装置内，36 ℃±1 ℃培养20 h～24 h。

5.2.4 典型的产气荚膜梭菌在TSC 琼脂平板上为黑色菌落。

5.3 确证试验

5.3.1 从单个平板上任选5 个（小于5 个全选）黑色菌落，分别接种到FTG 培养基，36 ℃±1 ℃培养

18 h～24 h。

5.3.2 用上述培养液涂片，革兰氏染色镜检并观察其纯度。产气荚膜梭菌为革兰氏阳性粗短的杆菌，有

时可见芽孢体。如果培养液不纯，应划线接种TSC 琼脂平板进行分纯，36 ℃±1 ℃厌氧培养20 h～24 h，

挑取单个典型黑色菌落接种到FTG 培养基，36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h，用于后续的确证试验。

5.3.3 取生长旺盛的FTG 培养液1 mL 接种于含铁牛乳培养基，在46 ℃±0.5 ℃水浴中培养2 h 后，每

小时观察一次有无“暴烈发酵”现象，该现象的特点是乳凝结物破碎后快速形成海绵样物质，通常会上

升到培养基表面。5 h 内不发酵者为阴性。产气荚膜梭菌发酵乳糖，凝固酪蛋白并大量产气，呈“暴烈发

酵”现象，但培养基不变黑。

5.3.4 用接种环（针）取FTG 培养液穿刺接种缓冲动力-硝酸盐培养基，于36 ℃±1 ℃培养24 h。在透

射光下检查细菌沿穿刺线的生长情况，判定有无动力。有动力的菌株沿穿刺线呈扩散生长，无动力的菌

株只沿穿刺线生长。然后滴加0.5 mL 试剂甲和0.2 mL 试剂乙以检查亚硝酸盐的存在。15 min 内出现红

色者，表明硝酸盐被还原为亚硝酸盐；如果不出现颜色变化，则加少许锌粉，放置10 min，出现红色者，

表明该菌株不能还原硝酸盐。产气荚膜梭菌无动力，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。

5.3.5 用接种环（针）取FTG 培养液穿刺接种乳糖-明胶培养基，于36 ℃±1 ℃培养24 h，观察结果。

如发现产气和培养基由红变黄，表明乳糖被发酵并产酸。将试管于5 ℃左右放置1 h，检查明胶液化情况。

如果培养基是固态，于36 ℃±1 ℃再培养24 h，重复检查明胶是否液化。产气荚膜梭菌能发酵乳糖，使

明胶液化。

6 结果与报告

6.1 典型菌落计数

选取典型菌落数在20 CFU～200 CFU 之间的平板，计数典型菌落数。如果：

a) 只有一个稀释度平板的典型菌落数在20CFU～200CFU 之间，计数该稀释度平板上的典型菌落；

b）最低稀释度平板的典型菌落数均小于20 CFU，计数该稀释度平板上的典型菌落；

c）某一稀释度平板的典型菌落数均大于200 CFU，但下一稀释度平板上没有典型菌落，应计数该稀

释度平板上的典型菌落；

d）某一稀释度平板的典型菌落数均大于200 CFU，且下一稀释度平板上有典型菌落，但其平板上的

典型菌落数不在20 CFU～200 CFU 之间，应计数该稀释度平板上的典型菌落；

e）2 个连续稀释度平板的典型菌落数均在20CFU～200CFU 之间，分别计数2 个稀释度平板上的典

型菌落。

6.2 结果计算

6.1 计数结果按公式（1）计算：

式中：

T——样品中产气荚膜梭菌的菌落数；

A——单个平板上典型菌落数；

B——单个平板上经确证试验为产气荚膜梭菌的菌落数；

C——单个平板上用于确证试验的菌落数；

n1 ——第一稀释度（低稀释倍数）经确证试验有产气荚膜梭菌的平板个数；

n2 ——第二稀释度（高稀释倍数）经确证试验有产气荚膜梭菌的平板个数；

0.1——稀释系数；

d——稀释因子（第一稀释度）。

6.3 报告

根据TSC 琼脂平板上产气荚膜梭菌的典型菌落数，按照6.2 中公式计算，报告每g（mL）样品中产

气荚膜梭菌数，报告单位以CFU/ g（mL）表示；如T 值为0，则以小于1 乘以最低稀释倍数报告。

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