一、实验目的和内容
目的：学习和掌握用试管凝集反应测定抗血清效价的方法。
内容：1、玻片凝集试验。
2、试管凝集试验。
二、实验材料和用具
含10亿个/mL大肠杆菌(E. coli)的生理盐水菌悬液、大肠杆菌抗血清、生理盐水。载玻片、小试管(1cm×6.5cm)、试管架、移液管、吸管、水浴箱。
三、操作步骤
(一)玻片凝集试验
1．在载玻片两端各滴一滴大肠杆菌悬液。
2．在一端的菌悬液中加入一滴1：10稀释的大肠杆菌抗血清，另一端悬液加入一滴生理盐水。
3．将载玻片小心地振动使混合液混匀后静置室温中，数分钟后便可观察到抗血清端产生凝集块，而另一端为生理盐水对照。若反应不明显，可放入培养皿中(皿内放入湿滤纸，以保持一定湿度)，37℃保温30min后观察结果。亦可将载玻片放置显微镜下，凝集块明显可见。
(二)试管凝集试验
1．抗血清的稀释  抗血清稀释采取对倍稀释法。取干净小试管10支，排列在试管架上，依次注明号码，每支试管用移液管加入0.5mL生理盐水。
用移液管吸取1：10稀释的大肠杆菌抗血清0.5mL加入第1管，在管内连续吹吸3次，使血清与生理盐水充分混合，然后吸取0.5mL加入第2管，同样混匀后吸取0.5mL加入第3管，依次类推，直至第9管，混匀后从第9管中吸取0.5mL弃去。第10管不加血清作为对照。此时从第1管到第9管的血清稀释倍数分别1：20，1：40，1：80，1：160，1：320，1：640，1：1280，1：2560，1：5120。
2．加入抗原   从第10支管开始，由后向前每支管依次加入0.5mL大肠杆菌菌悬液。此时血清稀释倍数相应加大一倍。
3. 抗原抗体反应   把各管混合液振摇混匀，置37℃水浴箱中水浴4h或在室温中过夜，观察结果。
4．结果观察与效价判断
(1)生理盐水对照管中的抗原(细菌)应分散，无凝集块沉淀而呈混浊菌悬液。
(2)试验管如有凝集，管底可见到凝集块。液体上部澄清、半澄清或混浊度降低，管底凝集块轻摇即浮起，呈片块状。
(3)凝集强弱的判断(以“+”表示)
“++++”：很强，表示细菌完全凝集，凝集块完全沉于管底，菌液澄清。
“+++”：很强，表示细菌绝大部分凝集，凝集块小沉于管底，菌液有轻微混浊。
“++”：中等强度，表示细菌部分凝集沉于管底，凝集块呈颗粒状，菌液半澄清。
“+”：弱，表示细菌少数凝集，菌液混浊。
“-”：不凝集，菌液混浊与生理盐水对照管同。
血清的效价就是呈现50%凝集(即“++”反应)的最高血清稀释倍数。
四、注意事项
1．所用载玻片、试管、移液管等用具均应干净。
2．在血清对倍稀释过程中，力求准确。一是防止液体溢出管外，二是在连续吸3次混匀液体时，第2次吸人移液管中的液体高度不能低于第1次，最好是每一稀释度换一支洗净的移液管。
3．试管水浴或静置后，观察前不宜摇动振荡，以免影响实验结果的准确性。
五、演示
1．对倍稀释过程。
2．玻片凝集的显微示范镜，观察凝集块。
六、实验报告
(一)记录玻片凝集试验结果，试比较血清端与生理盐水端结果的不同，并解释其原因。
(二)抗血清的效价测定结果。
1．抗血清效价测定结果：
                   
2．确定抗血清的效价为                。
七、问题和思考
1．为什么取“++”的抗血清最高稀释倍数作为抗血清的效价？
2．在试管凝集试验中，有否出现不正常现象？并分析其原因。
3．现有枯草孢杆菌斜面菌种及未知效价的相应抗血清，你能否测定出其血清效价？描述其操作过程
   
   

 

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