操作步骤

样品处理:

  冷冻样品应在45℃以下不超过15 min或在2℃～8℃不超过18 h解冻。若不能及时检验，应放于-15℃左右保存；

  非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验。若不能及时检验，应置于2℃～8℃冰箱保存，在24 h内检验。

样品制备

  以无菌操作取样品25 g（mL），加入PBS 225 mL，用旋转刀片式均质器以8000 r/min～10000 r/min均质1 min～2 min，或拍击式均质器拍击2 min。如无均质器，则将样品放入无菌乳钵中磨碎，然后称取25 g（mL）置合适的容器中，加225 mL PBS，充分振荡混匀。制成1:10的样品匀液。

增菌

  取1：10的样品匀液10 mL（液体样品可以选择原液），加入90 mL胰酪胨大豆多粘菌素肉汤中，于30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h。

分离

  取胰酪胨大豆多粘菌素增菌液划线接种于MYP琼脂平板上。于30 ℃±1 ℃培养24 h～48 h。观察平板上生长的菌落。在MYP琼脂平板上，典型菌落为灰白色至微粉红色，周围有白色至淡粉红色沉淀环。

纯培养

  从每个平板选取至少5个典型或可疑菌落，划线接种于营养琼脂平板做纯培养，30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h，进行确证实验。营养琼脂平板上，典型菌落在为灰白色，偶有黄绿色，不透明，表面粗糙似毛玻璃状或融蜡状，边缘常呈扩展状，直径为4 mm～10 mm；

样品的稀释

     吸取1：10的样品匀液1 mL加到装有9 mL PBS的稀释管中，充分混匀制成1：100的样品匀液。据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。

平板计数

  选择2～3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度分别吸取0.1mL接种到MYP琼脂平板上，每稀释度接种两个MYP琼脂平板。用无菌L棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。使用前，如MYP琼脂平板表面有水珠，可放在25℃ ～ 50℃的培养箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。

  涂布后，将平板置于30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h后（原标准为36 ℃±1 ℃培养12 h～20 h） ，选取具有15个～150个典型或可疑蜡样芽胞杆菌菌落的平板，进行计数。并计算同一稀释度两个平板的平均菌落数。如果菌落不典型，可继续培养18 h～24 h再计数。

  计数后，从每个平板选取至少5个已计数的典型或可疑菌落，如果一个平板上少于5个典型或可疑菌落，则取所有典型或可疑菌落，分别划线接种于营养琼脂平板， 30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h，进行确证实验。

  根据确证实验确定为蜡样芽胞杆菌的菌落数，按比例计算出该平板上蜡样芽胞杆菌菌落数，然后计算同一稀释度两个平板的平均蜡样芽胞杆菌数，再乘其稀释倍数，再乘以10，即得每g（mL）样品中蜡样芽胞杆菌数并作出报告。

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