常用简易保藏法

一、目的

了解常用简易保藏法的原理，掌握其操作方法。

二、原理

常用简易保藏法包括斜面低温保藏法、半固体穿刺保藏法、液体石蜡保藏法、甘油保藏法，沙上管保藏法等。由一这此保藏方法只需要特殊设备，操作简便易行，故为一般实验空及生产单位所广泛采用。

斜面低温保藏法和半固体穿刺保藏法是将在斜面或半固体培养基上己生长好的培养物置于4~5℃冰箱屮保藏。这两种方法都是利用低温抑制微生物的生长繁殖，从而延长保藏时间。

液体石蜡保藏是在新鲜的斜面培养物上，覆盖一层经过灭菌的液体石蜡，再置于4~5℃冰箱中保藏。液体石蜡主要起隔绝空气作用，故此法是利用缺氧低温双重抑制微生物生长，从而延长保藏时间。

甘油保藏法是在液体的新鲜培养物中加入适量的经过灭菌的甘油，然后再置于-20℃或-70℃冰箱中保藏。此法适用于甘油作为保护剂，甘油透入细胞后，能强烈降低细胞的脱水作用，同时在低温条件下，可大大降低细胞代谢水平，达到延长保藏时间的目的。

沙土管保藏法是将待保藏菌种接种于斜面培养基上，经培养后制成孢子悬液，将孢子悬液滴入已灭菌的沙土管中，孢子即吸附在沙子上，将沙土管置于真空干燥器中，吸干沙土管中水分，经密封后至于-4℃冰箱中保藏。此法利用干燥、缺氧、缺乏营养、低温等因素综合抑制微生物生长繁殖，从而眼残保藏时间。

三、材料

1.菌种  细菌、放线苗、酵母菌及霉菌。

2.培养基  肉膏蛋白胨斜面及半固体深层培养基、豆芽汁葡萄糖斜面培养基、高氏一号斜面培养基、LB液体培养基。

3.其他  无菌液体石蜡、无菌甘油、带螺口盖和密封圈的无菌试管或1.5ml无菌Eppendorf管、100ml三角瓶。

四、方法与步骤

1.斜面低温保藏法（适用于细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的保藏〕将菌种接种在适宜的培养基斜面上，在适宜的温度培养，使其充分生长。如果是能形成芽孢或孢子等休眠体的菌种，待形成芽孢成孢子等休眠体后再置于4~5℃冰箱中进行保藏。

不同种类的微生物有不同的保藏期，到期后需转接至新的斜面培养基上，经适当培养后，再行保藏。此法优点是操作简便，不需要特殊设备；缺点是保藏时间短，菌种经反复转接后，遗传性状已发生变异，生理活性减退。各类微生物的培养条件见表14-1。

2.半固体穿刺保藏法（适用于兼性厌氧细菌或酵母菌的保藏）用穿剌接种法将菌
种接入半固体深层培养基中央部分，注意不要穿透底部。在适宜的温度培养，使其充分生长。培养好的菌种置于4-5℃冰箱保藏。一般保藏0.5a到1a后，需转接到新的半固体深层培养基中，经培养后再行保藏。

3.液体石蜡保藏法〈适用于真菌和放线菌保藏）

（1）无菌液体石蜡制备  将液体石蜡罝1于100ml的三角瓶内，毎瓶裝10ml，塞上棉塞，外包牛皮纸、高压蒸汽灭菌（0.1Mpa30min）。灭菌后将装有液体石蜡的三角瓶置于105~110℃的烘箱内约1h，以除去液体石蜡中的水分。

(2)接种、培养及保藏  将菌种接种在适宜的斜面培养基上，在适宜的温度下培养，使其充分生长。用无菌吸管吸取无菌液体石蜡，注入到已生长好菌的斜面上，液体石蜡的用量以高出斜面顶端1cm左右为准，使菌种转接至新的斜面培养基上，培养后加入适量灭菌液体石蜡，再行保藏。

4.甘油保藏法（常用于细菌保藏）

（1）无菌甘油制备  将甘油置于100ml的三角瓶中，每瓶装10ml，塞上棉塞，外包牛皮纸，高压蒸汽灭菌（0.1Mpa20min）。

(2)接种、培养及保藏  挑取一环菌种接入LB液体培养基试管中，37℃振荡培养至充分生长。用吸管吸取0.85ml培养液，置于一只带有螺口盖和空气密封圈的试管中或一支1.5ml的Eppendorf管中，再加入0.15ml无菌甘油，封口，振荡混匀。然后将其置于乙醇-干冰或液氮中速冻。最后将已冰冻的含有甘油的培养物置于-20~70℃保藏，保藏期为0.5~1a。

到期后，用接种环从冻结的表面刮去培养物，接种至LB斜面上，37℃培养48h。然后用接种环从斜面上挑取一环长好的培养物，置入装油2mlLB培养液的试管中，再加入2ml含30%无菌甘油的LB液体培养基，振荡混匀。最后分装于带有螺口盖和密封圈的无菌试管中或1.5的Eppendorf管中，按上述方法速冻保藏。

5.沙土管保藏法（适用于产孢子的芽孢杆菌、梭菌、放线菌和霉菌的保藏）

（1）无菌沙土管制备  取河沙若干，用40目筛子过筛，出去大的颗粒。再用10%HCL溶液浸泡2-4h除去有机杂质，倒出盐酸，用自来水从洗至中性，烘干。另取非耕作层瘦黄土若干，磨细，用100目筛子过筛。取1份制备的土加加4份沙混合均匀，装入小试管中（如血清管大小）。装量约1cm高即可，塞上棉塞，0.1Mpa灭菌1h，每天一次，连续3d。

 （2）制备菌悬液  吸取3~5ml无菌水至一支已培养好的菌种斜面中，用接种环轻轻搅动培养物，使呈菌悬液。

 （3）加样及干燥  用无菌吸管吸取菌悬液，在毎支沙土管中滴加4~5滴菌悬液，塞上棉塞，振荡摇匀。将已滴加菌悬液的沙土管置于预先放有五氧化二磷或无水氯化钙的干燥器内。当五氧化二磷或无水氯化钙因吸水变成糊状时，则应进行更换。如此数次，沙土管即可干燥。也可用真空泵连续抽气约3h，即可达到干燥效果。

 （4）抽样检查  从柚干的沙土管中，每10支抽取1支进行检査。用接种环取少许沙土，接种到适合于所保藏菌种生长的斜面上，进行培养，观察所保藏菌种的生长及有无杂菌生长情况。

（5）保藏  检查合格后，可采用以下方法进行保藏：①沙土管继续放入干燥器中，置于室温或冰箱中。②将沙土管带塞一端浸人熔化的石蜡中，密封管口。③在煤气灯上，将沙土管的棉塞下端的玻璃烧熔.封住管口，再置4℃冰箱中保藏。此法可保截菌种1年到数年。

                表14-1各种微生物斜面培养条件及保藏期  

菌类	培养基名称	培养温度（℃）	培养时间（d）	保藏温度（℃）	保藏时间（min）
细菌	肉膏蛋白胨斜面	30~37	1-2	4-5	1-3
放线菌	马铃薯葡萄糖或  高氏合成一号斜面	25~30	5-7	4-5	3-6
酵母菌	豆芽汁葡萄糖或  麦芽汁斜面	25~30	2-3	4-5	2-4
霍菌	豆芽汁葡萄糖或  麦芽汁斜面	25~30	3-5	4-5	3-6

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