1 增菌

用无菌操作取样品25g，加入有225mL的增菌液中（银耳取样品1g，加入有20mL的增菌液中）置于36±1℃恒温培养箱中培养48h。

2 平板分离

取增菌液1环，划线按种PDA平板， 36±1℃培养24~48h。

PDA平板：菌落1~2mm，灰白色或乳白色，光滑、湿润、边缘整齐。培养48h后，中心有凸起，呈草帽状，菌落周围有黄绿色素扩散到基质中。

卵黄琼脂平板：菌落表面光滑、湿润，48h后，菌落周围形成乳白色混浊环，斜射日光下可见环的表面呈虹彩现象。

SS琼脂平板：不生长或微弱生长。

3 纯化

从卵黄琼脂平板上挑取卵黄脂酶阳性，并带有虹彩环的单个菌落，接种PDA斜面， 36±1℃培养24h。

4 生化试验

从纯化培养的PDA斜面上挑取少量菌苔，分别接种于Hugh－Leifson培养基、蛋白胨水、缓冲蛋白胨水、西檬氏柠檬酸盐培养基、糖发酵管及苯丙氨酸培养基， 36±1℃培养，按单项试验要求分别进行观察。产毒培养

取已确证为椰毒假单胞菌酵米面亚种的菌株接种PDA斜面，36±1℃，培养24h，加入3mL灭菌生理盐水，制成约100亿/mL的菌悬液，用无菌吸管吸取0.5mL，滴在铺好灭菌玻璃纸的半固体PDA平板上，用灭菌L形棒涂布均匀， 26±1℃，培养5d。取下带菌的玻璃纸，将半固体平板放入消毒锅内，100℃流动蒸汽灭菌30min。室 温冷却后，置－10~－20℃冰箱过液。将冰冻好的半固体平板置室 温融化，用灭菌吸取出冻融液，经滤纸过滤放灭菌试管或三角烧瓶中，4℃避光保存，此为粗毒素。

动物试验

 取粗毒素或经水浴蒸发的5~10倍浓缩液0.5mL，灌胃体重为18~20g的小白鼠3只，观察7天。若菌株产米酵菌酸，小白鼠在灌胃后20min~24h内发病、死亡。主要症状为竖毛，萎靡不振，继而躁动，行步蹒跚、肢体麻痹、瘫软、抽搐，呈角弓反张状，呼吸急促、死亡。

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