诺如病毒（Norovirus，NV）是引起全世界所有年龄组人群急性胃肠炎暴发流行的重要病原之一。属杯状病毒科，诺如病毒属单股正链RNA病毒，其基因组长度为7 kb～7.5 kb，病毒直径约为26 nm～35 nm，无包膜，表面粗糙，球形，呈二十面体对称；电镜下缺乏显著的形态学特征，负染色电镜照片显示，NV是具有典型的羽状外缘，表面有凹痕的小圆状结构病毒。

方法原理

在甘氨酸缓冲液中通过物理研磨对分离出的样品均质以释放病毒，PEG8000沉降病毒。提取总RNA后，进行进一步纯化。利用普通RT-PCR和实时荧光RT-PCR进行检测，对可疑的PCR产物进行测序分析确定其基因型别。

病毒的富集

无菌取样，在5 g检样中加入35 mL甘氨酸缓冲液（样品重量与缓冲液体积之比为1:7）；组织匀浆器中高速匀浆3 min，充分破碎混匀。

将所有均质液转移到50 mL离心管中，37 ℃孵育30 min或室温下振荡30min；4 ℃，10000×g离心30 min。

取上清，加入10ml氯仿或更多，充分振摇，放置10min，中间振摇一次，4 ℃，10000×g离心30 min。

取上清至另一干净的100 mL离心管中，加入等体积的PEG 8000溶液（PEG终浓度为8%），上下颠倒离心管以充分混匀。

7.2.5 冰上放置至少1 h，4℃，10000×g离心5 min。弃去上清，保留沉淀。

上一篇：下一篇：大肠埃希氏菌分离与初步生化试验