实验目的、要求

（1）学习并掌握细菌、放线菌、霉菌和酵母菌等四大类微生物的稀释分离、划线分离等技术。

（2）学习从样品中分离、纯化出所需菌株。

（3）了解四大类微生物的培养条件和培养时间。

       以细菌为例

实验原理

纯种分离技术是微生物学中重要的基本技术之一。分离：从混杂的微生物群体中获得单一菌株纯培养的方法。纯种（纯培养）：一株菌种或一个培养物中所有的细胞或孢子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。

微生物的分离与纯化技术的应用：分离具有特殊功能的微生物、优良菌种及纯化被污染的菌种等。

土壤是微生物的大本营，混杂着大量的微生物，从中分离可得到只含有这一种微生物的纯培养。

稀释分离法有倾注法和涂布法两种；菌种被其他杂菌污染时或混合菌悬液常用划线法进行纯种分离。

要获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。

微生物四大类菌的分离培养基、培养温度、培养时间详见实验指导书P67表格。细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基，在30-37℃ 温度下培养1-2天。

平板菌落计数——活菌计数

实验仪器、材料

实验材料    菌源:土样10g;

培养基   牛肉膏蛋白胨培养基;

实验仪器与用具

1)超净工作台、恒温培养箱、酒精灯

2）1000ul及100ul移液枪、1000ul及100ul枪头、无菌1.5ml的离心管、离心管架

3）无菌平皿、涂布棒、接种环

实验试剂:无菌水;

实验内容

1、采土样:
   选择肥沃土壤,去表层土,挖5－20cm深度的土壤数10g,装入已灭菌的牛皮纸袋,封好袋口,带回实验室。

2、制备土壤稀释液：

       称取土样1.0g，放入盛99ml无菌水的三角瓶中，置摇床振荡20min使土壤均匀分散成为土壤悬液（10-2）。用100ul移液枪从中吸取100ul土壤悬液，注入事先分装有900ul无菌水的离心管中，吹吸3次，振荡均匀（10-3）。然后同样方法，配置成稀释度为10-4，10-5的土壤菌悬液。

3、分离
1）涂布法

     用一支新的无菌枪头，由低浓度开始，从各浓度土壤稀释液中各吸取100ul，对号较均匀地放入已写好稀释度的牛肉蛋白胨培养基平板上，用灼烧冷却后的无菌玻璃涂棒涂匀。每个浓度做3个平板（重复）。

2）倾注法

     用一支新的无菌枪头，由低浓度开始，从各浓度土壤稀释液中各吸取100ul，对号较均匀地放入已写好稀释度的空白无菌平皿中，然后在各平皿中加入已经融化并冷却到45 -50℃的牛肉膏蛋白胨培养基（已灭菌）12-15ml，将培养皿在超净工作台面上轻轻转动，使稀释的菌悬液与融化的培养基混合均匀，直至培养基凝固。

注意：无菌操作；用枪头吸取菌悬液时注意“吹打数次”确保混匀。

4、培养

待平板上液体被完全吸收，将平板倒置于370C温箱中培养24h；

5、菌落计数
含菌样品的微生物经稀释分离培养后，每一个活菌细胞可在平板上繁殖形成一个肉眼可见的菌落，故可据平板上菌落的数目推算出每克含菌样品中所含的活菌总数（菌落形成数目）。

每克含菌样品中微生物的活细胞数（菌落形成数，CFU＝

（同一稀释度平板上菌落平均数× 10×稀释倍数）/含菌样品克数

菌落计数规则：

选择平均菌落数在30~300间的平板

（1）只有一个稀释度符合，以该稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告；

（2）有两个稀释度符合，取决于二者比值（高稀释度的菌落数除以低稀释度的菌落数的值）：

   a)若0.5≤比值≤2，以两稀释度的菌落数乘稀释倍数所得的值的均值报告。

   b)若2≤比值或比值≤ 0.5，则取其中较少的菌落总数进行报告。

 （3）若所有稀释度的菌落平均数均大于300，则按稀释倍数最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告；

 （4）若所有稀释度的菌落平均数均小于30，则按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告；

所有菌落数均不在30~300间

以最接近30或300的平均菌落数乘稀释倍数

6、斜面接种

    选择分离效果较好，认为已经纯化的单菌落，挑选一个，用接种环接种斜面。贴好标签。

7、培养

     置370C恒温箱中培养24h，置冰箱保藏。

结果与讨论

计算含菌样品中的所含活菌总数

在恒温箱中培养微生物时为何要倒置？

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