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2 结果与讨论
2.1 影响0．intermedium DN2生长的关键因素
利用JMP软件对 Plackett-Burman试验结果进行方差分析。结果表明，影响菌株 DN2生长的显著因素 (α=0.05)为：胰蛋白胨(P=0.004)、MgSO4·7H2O(P=0.033)、温度(P=0.008)、装液量(P=0.030)和培养时间(P=0．004)。本次实验 pH值取值在最佳的水平范围内，统计分析并未将此作为显著因子。但 pH值是影响细菌生长的重要因素，因此下一步实验也将予以考虑。菌株DN2是好氧菌，装液量和转速均影响其生长。但是本次试验装液量和转速的 P值分别为0.030和0.086，说明装液量对 DN2生长的影响比转速大。而本次试验选取α在0.05水平上的影响因子，故下一步试验不考虑转速。
2．2 响应面优化DN2生长培养基
在对 Plackett-Burman试验结果分析的基础上，采用CCRD设计对影响DN2生长的关键内在因素胰蛋白胨、MgSO4·7H2O以及初始pH值进行了20组试验，结果见表 2。
表2 旋转中心组合设计及其实验结果
|
实验编号 |
X1(蛋白胨) |
X2(MgSO4.7H2O) |
X3(初始pH值) |
菌体浓度（lg cfu/ml） | |
|
实测值 |
预测值 | ||||
|
1 |
-1 |
-1 |
-1 |
8.741 |
8.723 |
|
2 |
1 |
-1 |
-1 |
8.858 |
8.831 |
|
3 |
-1 |
1 |
-1 |
8.800 |
8.765 |
|
4 |
1 |
1 |
-1 |
8.720 |
8.724 |
|
5 |
-1 |
-1 |
1 |
8.646 |
8.642 |
|
6 |
- |
-1 |
1 |
8.879 |
8.915 |
|
7 |
-1 |
1 |
1 |
8.582 |
8.609 |
|
8 |
1 |
1 |
1 |
8.715 |
8.734 |
|
9 |
-1.682 |
0 |
0 |
8.678 |
8.696 |
|
10 |
1.682 |
0 |
0 |
8.911 |
8.892 |
|
11 |
0 |
-1.682 |
0 |
8.747 |
8.755 |
|
12 |
0 |
1.682 |
0 |
8.646 |
8.637 |
|
13 |
0 |
0 |
-1.682 |
8.789 |
8.834 |
|
14 |
0 |
0 |
1.682 |
8.821 |
8.775 |
|
15 |
0 |
0 |
0 |
9.123 |
9.126 |
|
16 |
0 |
0 |
0 |
9.102 |
9.126 |
|
17 |
0 |
0 |
0 |
9.144 |
9.126 |
|
18 |
0 |
0 |
0 |
9.155 |
9.126 |
|
19 |
0 |
0 |
0 |
9.107 |
9.126 |
|
20 |
0 |
0 |
0 |
9.123 |
9.126 |
从胰蛋白胨、MgSO4·7H20与pH值交互影响DN2菌体浓度的响应面图(图 1)，可直观地看出各因子对响应值影响的变化趋势。
2.3 响应面优化DN2生长的外部条件
Plackett-Burman试验结果表明，温度、装液量和培养时间是影响DN2生长的关键外在因子。Box—Behnken设计对影响 DN2生长的关键外在因素进行了17组试验，结果见表3。利用Design—Expert软件对表 3试验数据进行二次多项回归拟合，获得菌体浓度对温度、装液量以及培养时间的二次多项回归方程为：（略）
对回归方程取一阶偏导等于 0并整理可得培养条件最优化值为：X4=32℃，X =88ml，X =34h。 此时，最大预测菌体浓度为6．73×10 9cfu／ml。图2是温度、装液量与时间交互影响 DN2菌体浓度的响应面图。从图中可直观地看出各因子对响应值影响的变化趋势。
表3 Box-Behnken设计及其实验结果
|
实验编号 |
X4(温度) |
X5(装液量) |
X6(时间) |
菌体浓度（lg cfu/ml） | |
|
实测值 |
预测值 | ||||
|
1 |
-1 |
-1 |
0 |
9.378 |
9.385 |
|
2 |
1 |
-1 |
0 |
9.325 |
9.279 |
|
3 |
-1 |
1 |
0 |
9.166 |
9.212 |
|
4 |
1 |
1 |
0 |
9.219 |
9.212 |
|
5 |
-1 |
0 |
-1 |
9.113 |
9.120 |
|
6 |
1 |
0 |
-1 |
9.113 |
9.173 |
|
7 |
-1 |
0 |
1 |
9.590 |
9.530 |
|
8 |
1 |
0 |
1 |
9.378 |
9.371 |
|
9 |
0 |
-1 |
-1 |
9.537 |
9.524 |
|
10 |
0 |
1 |
-1 |
9.272 |
9.219 |
|
11 |
0 |
-1 |
1 |
9.590 |
9.643 |
|
12 |
0 |
1 |
1 |
9.696 |
9.709 |
|
13 |
0 |
0 |
0 |
9.696 |
9.622 |
|
14 |
0 |
0 |
0 |
9.643 |
9.622 |
|
15 |
0 |
0 |
0 |
9.643 |
9.622 |
|
16 |
0 |
0 |
0 |
9.643 |
9.622 |
|
17 |
0 |
0 |
0 |
9.484 |
9.622 |
2．4 优化前后菌株 DN2的生长曲线经过上述优化后，得到最佳培养基组成为(g／L)：胰蛋白胨 11.34牛肉膏3.00、NaCl 5.00、MgSO4·7H20 3.7l，pH值7.23；最佳外界条件：温度32℃、转速12Or／min、装液量88ml／250ml三角瓶、培养时间34h。在此优化条件的基础上进行5L发酵罐实验，以优化前的培养基和培养条件作为对照，每4h测定培养液中的菌体浓度(图3)。从图3中可以看出，优化后菌株DN2达到最大生长量的时间为36h，与预测值34h基本一致，且比优化前的48h缩短约12h；最大活菌数达到6.49×109cfu／ml，比优化前的7.35×108cfu／ml提高了一个数量级，与预测值6.73×109cfu／ml较为接近。
3 结 论
本文通过Plackett—Burman实验筛选出胰蛋白胨、MgSO4·7H20、温度、装液量和培养 时间为影响0．intermedium DN2菌株生长的显著因素。在此基础上，采用响应面法优化菌株 DN2的培养条件，得到最佳培养基组成为(g／L)：胰蛋白胨11.34、牛肉膏3.0、NaCl 5.0、MgSO4·7H2O 3.7l，pH值7.23；最佳外界条件为温度32℃、转速 120r／min、装液量 88ml／250ml、培养时间34h。在此优化培养条件的基础上进行 5L发酵罐验证试验。结果表明，菌株 DN2达到最大生长量的时间为36h，比优化前缩短了约12h；最大菌体浓度为6.49×109 cfu／ml，比优化前的7.35×108cfu／ml提高了一个数量级，与预测值 6．73×109 cfu／ml较为接近。本研究结果为 0．intermedium DN2的研究与应用打下基础。
作者：袁勇军 黄丽金 陆兆新
作者单位：南京农业大学食品科技学院农业部农畜产品加工与质量控制重点开放实验室 南京 210095
参考文献 (略)
