大量提取质粒DNA（CsCl 密度梯度离心法）
录入时间:2011-9-8 17:06:35
来源：生物在线
大量提取质粒DNA（CsCl 密度梯度离心法）
李渊越
1. 预约摇床、超速离心机。
2. 配 TB 培养基（1L 锥形瓶中装250 ml 培养液），并灭菌。质粒做好转化，并涂板。
3. 第一天早上，往 TB 中加入适量的Amp 或Kana。挑菌，37 ℃摇床培养 24 h，至OD600 到10-15。
4. 检查以下药品：25％ sucrose in 50 mM Tris-HCl（pH8.0）>250mL、lysozyme 粉末>1g、0.5 M EDTA
（pH8.0）>50mL、RNase A（100 mg/ml）>150uL、Triton-lysis>100mL、PEG8000>300mL、1×TE>150mL、
CsCl>250g、正丁醇>2 瓶、EB>2mL。
5. 第二天早上，把菌液倒入离心瓶中，用 Beckman J6-MI 离心机以4,200 rpm, 20 min 离心。离心后，把
上清倒干。在离心的时候，配Lysozyme 25mL。并将RNase 置于室温。
6. 弃上清，以 20ml 25％ sucrose in 50 mM Tris-HCl（pH8.0），重悬至菌完全分散。
7. 加入 4ml 新配制的lysozyme-EDTA-RNase 溶液。混匀，室温静置10 min 以上。
8. 在静置的同时，准备好高速离心管，往里面各加入 5ml Triton-lysis。
9. 将 lysozyme-EDTA-RNase-DNA 溶液倒入高速离心管中，使用JA-30.50 Ti 转头，100,000g, 15min。
10. 将上清倒入新管中（不要把沉淀倒出来），加入PEG8000 使总体积至50mL（1/2 体积），颠倒混匀，
于4 ℃中放置2 h 以上（过夜更好）。
11. 4,000 g 5 min，去上清，加入8.5ml TE，溶解至无沉淀。
12. 加入 11.00 g（要精确到小数点后2 位，便于配平）CsCl，溶解完全。
13. 在超离管中用 200ul 枪加入100ul EB（2mg/ml），将溶液通过20mL 一次性注射器移入超离管中，用
TE 将液面补平至近管口。
14. 补加 TE 至液面到超速离心管管口。
15. 称出每管重量，配平，封口。任选以下一种条件在 20℃下进行密度梯度离心：
转头 转速 时间
Type 70.1 Ti 70,000rpm 20h
NVT65 60,000rpm 16h
NVT65 65,000rpm 8h
16. 灭 250mL 以上的超纯水，并配好至少500mL 灭菌水饱和正丁醇。
17. 超离后，取样品，用5 ml 注射器加上12#针头，抽取EB 带，（离心完可见两条EB 带，上面一条细浅
的带为断裂的质粒DNA,应抽取下面一条粗浓的EB 带）放入50ml 管中。
18. 以灭菌水饱和正丁醇溶液萃取 EB，直到溶液澄清无色。
19. 加入等体积 TE（一定要加。若不加，在无水乙醇沉淀时，会沉淀下部分CsCl）。
20. 加入 2 倍体积预冷的无水乙醇，混匀（如果不充分混匀，可能会导致离下的DNA 是透明的，容易随
上清一起倒掉）。6,000rpm，20min，（注意方向）去上清（注意沉淀不会贴壁，不要倒掉）。
21. 加入 450 μl (~900ul)水，把50mL 离心管平放（注意方向），溶解，直到溶解完全（约需室温过夜）。
22. 用枪小心将液体吸入 1.5mL 离心管中（如>450ul，可分成两管），加入十分之一体积的3 M NaAc (pH
5.2)，再加入2 倍体积预冷的无水乙醇，混匀，置于4C 或-20C 15-30min。13,000 rpm 离心10min。
23. 用 1mL 70%预冷的乙醇洗沉淀一次，13,000rpm 离心10min。
24. 去上清，以 1mL TE 溶解完全，测定浓度。
大量提取质粒DNA（CsCl 密度梯度离心法） 2010-7-7
lysozyme-EDTA-RNase 溶液
溶菌酶 0.4 g
0.5M EDTA (pH=8.0) 25mL
RNase A (100mg/mL) 120uL
H2O 25mL
25％ 蔗糖:
蔗糖 25 g
1 M Tris-HCl（pH 8.0） 5 ml
过滤，加纯水定容至100 ml，置于4 ℃保存。
0.5 M EDTA（pH 8.0）:
EDTA·Na·2H2O 186.1 g
NaOH 约20 g
加800 ml 纯水溶解完全后，调pH 至8.0，定容至1 L，湿热灭菌，常温保存。
Triton-lysis:
10% Triton-100 5mL
1 M Tris-HCl（pH 8.0） 15 mL
H2O 100mL
湿热灭菌，常温保存。
PEG8000：
PEG8000 150 g
5 M NaCl 150 ml
加纯水定容至500 ml，湿热灭菌，常温保存。
EB（2mg/ml）：
EB 20mg
加超纯水10ml，溶解，室温保存。
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