一、实验目的：掌握微生物斜培养基确定方法，学会对已确定菌种确定实验室发酵工艺。
二、实验原理：筛选微生物最适生长及产物形成的营养条件和培养条件，以确定特定产物发酵的工艺参数。
三、仪器及试剂 ：蔗糖，酵母膏，MgSO4等
高压灭菌锅、洁净工作台、恒温振荡培养箱。
四、操作方法：
1、种子培养基
2、产酶培养基确定
2.1培养基的配制，各组分别选择以下六种培养基配方：
（1）基础培养基：（100ml）豆粕粉3g，蔗糖0.8g，酵母膏0.1g，MgSO4 0.36g，KH2PO4 0.12g，CaCl2 0.1g。（第一组）
（2）第二组，将基础培养基中蔗糖按成等例葡萄糖；
（3）第三组，将基础培养基中蔗糖按成等例马铃薯淀粉；
（4）第四组，将基础培养基中去掉酵母膏；
（5）第五组，将基础培养基中去掉豆粕粉，并将酵母膏添加量增至0.5％。
（6）第六组，将基础培养基中去掉MgSO4 和CaCl2。
2.2培养基灭菌
高压灭菌锅，121℃，20min灭菌。冷却至室温，将上述物品并洗耳球转入超净台，接种前20min进行紫外空气灭菌。
2.3接种
冷却到室温开始接种，接种量10％，然后在在28℃、250r/m的条件下培养至发酵液颜色变深、澄清为止。
2.4酶活力测定
根据各组测定酶活结果，比较确定适宜培养基组成。
（1）定义：1 g固体酶粉，在一定温度和pH值条件下，1 min水解酪素产生1 ug酪氨酸为一个酶活单位，以u/g表示。
（2）原理：蛋白酶在一定温度与pH条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。根据吸光度计算其酶活力。
（3）试剂和溶液
① 三氯乙酸（CCl3.COOH）=0.4 mol/L：称取三氯乙酸32.7 g，用水溶解并定容至500 mL
② 磷酸缓冲溶液
③ 100 ug/mL L—酪氨酸标准溶液
④ 10 g/L酪素溶液
⑤ 待测酶液：取1ml发酵液稀释备用。
（4）分析步骤
① 求K值
② 测定
a. 先将酪素溶液放入（40±0.2）摄氏度恒温水域中，预热5 min；
b. 按下列程序操作：
试管A（空白） （第二试管） 试管B（酶试样，作三个平行样）（第三试管）
↓ ↓
加酶液2.00 mL （移液管2ml） 加酶液2.00 mL
↓（40±0.2℃），2 min ↓（40±0.2℃），2 min
加三氯乙酸4.00 mL（摇匀）（移液管5ml） 加酪素2.00 mL（摇匀）
↓（40±0.2℃），10 min ↓（40±0.2℃），10 min
加酪素2.00 mL（摇匀）（移液管2ml） 加三氯乙酸4.00 mL（摇匀）
↓ ↓
取出静止10 min，过滤 （第四试管，小漏斗） 取出静止10 min，过滤
↓ ↓
在275 nm波长下，用 10 mm 在275 nm波长下，用 10 mm
比色皿测其吸光度 比色皿测其吸光度
（5）计算（=135）
X=A×K×8/2×1/10×n×E=2/5×A×K×n×E
式中 X——样品的酶活力（u/g） A——试样溶液的平均吸光度
K——吸光常数（K=135） 8——反应试剂的总体积（mL）
2——吸取酶液2.00 mL，以1 mL计 1/10——反应时间10 min，以1 min计
n——稀释倍数 E——紫外法与福林法的换算系数（取0.50）
五、实验进程安排及结果分析
（1）第1次实验：配制培养基，灭菌，等待灭菌时进行发酵罐的上罐观察。
（2）第2次实验：下摇瓶，测定发酵液中蛋白酶活力，对比各组实验，确定培养基；或从发酵罐上取样，测定发酵液中蛋白酶活力。
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