曹国文¹ 曾代勤¹ 刘俐君² 陈春林¹ 戴荣国¹

（1、重庆市畜牧科学研究院兽医研究所 荣昌 402460 2、西南大学荣昌校区 ）

摘要：本试验将芦荟多糖作为免疫佐剂，制备芦荟多糖里默氏杆菌灭活菌苗，接种3日龄雏鸭，首免后10天进行二免，于首免后7d（以后间隔3d）采血分离血清，采用试管凝集反应监测其抗体升长情况，并于首免后16d进行攻毒试验，比较芦荟多糖佐剂菌苗与未加佐剂的甲醛灭活菌苗的免疫效果。抗体检测结果，芦荟多糖能明显促进灭活菌苗特异性抗体的产生，尤其是高剂量（10mg/mL）芦荟多糖组，产生抗体时间明显早于低剂量（5mg/mL）组和未加芦荟多糖组，而抗体滴度也明显高于其它组；空白对照组血清中抗体滴度始终为零；甲醛灭活菌苗组具有一定免疫原性，但产生抗体的时间晚，滴度亦较低。攻毒试验结果：高剂量芦荟多糖组保护率为33.3％，而甲醛菌苗保护率仅11.1％，未注射疫苗组攻毒后全部死亡。试验结果表明，芦荟多糖佐剂灭活菌苗免疫效果明显优于未加芦荟多糖的灭活菌苗，证明芦荟多糖佐剂能够增强灭活菌苗的免疫效果。

关键词：鸭疫里默氏杆菌   芦荟多糖佐剂   灭活菌苗   免疫效果

鸭疫里默氏杆菌病又名鸭传染性浆膜炎（Infectious  serositis  in duckling），该病是由鸭疫里默氏杆菌（Riemerella  anatipestifer  RA）引起的严重危害雏鸭和幼鸭的一种传染病。自1982年由郭玉璞^[1]首次报道本病以来，全国各省市自治区均相继有报道。该病无明显的季节性，一年四季均可发生，感染率可高达90%，死亡率1%～80%不等（高的可达90%以上）耐过鸭生长不良，增重缓慢，失去饲养价值，而且该病在发病场能持续存在，引起不同批次的鸭感染发病，给养鸭业造成严重的经济损失^[2]。RA极易产生耐药性，在临床治疗上已经难以找到这种细菌敏感的药物^[3]。由于该菌血清型多且交叉抗原存在较少，截止目前，抗菌药物和自家菌苗成为治疗和预防该病的有效措施^[4.5.6]。中药作为免疫增强剂报道较多，但用作疫苗佐剂的报道较少，本试验以中药芦荟提取多糖，作为疫苗佐剂添加于鸭疫里默氏杆菌甲醛灭活菌苗中，进行免疫效果的对比试验，获得明显的免疫增效作用，为寻求新的疫苗佐剂奠定了基础，现将研究结果报道如下。

1.材料和方法

1.1实验材料

鸭疫里氏杆菌菌株：标准Ⅰ型：由南京农业大学中国农业部动物疫病重点诊断实验室惠赠。野毒株分自重庆市九龙坡区白市驿某养鸭场。

芦荟多糖：由重庆市畜牧科学研究院兽医研究所动物药品研究中心从库拉索芦荟中提取，含多糖44％以上。

家兔与3日龄雏鸭：健康家兔与雏鸭，均购自荣昌县水口寺农贸市场。

1.2主要试剂

营养琼脂培养基：（北京奥博星生物技术有限责任公司 批号：20041023）。兔血琼脂培养基：营养琼脂培养基加5％兔血制成。麦康凯琼脂培养基：（上海市医学化验所试剂厂 批号：930401）。革兰氏染液、微量生化鉴定管、去离子水、生理盐水均由重庆市畜牧科学研究院兽医研究所自制。

1.3 主要仪器设备

生物摄影显微镜（BH-2.Olympus）、恒温培养箱（PYX-YDH-50×6上海市跃进医疗器械一厂）、4℃冰箱（华凌冰箱 BCO-188@HC 广东广州市）、-75℃超低温冰箱（美国Revco ULT1386-3v）、超净工作台（蚌埠净化设备厂）、高压蒸汽灭菌器（上海佳胜实验设备有限公司）、烘箱（CS101 3型。中华人民共和国重庆试验设备厂）、离心机（TDL-5.上海安亭科学仪器厂）。各种相关试剂均均购自重庆市医药化学试剂公司。

1.4 细菌的分离鉴定

1.4.1 细菌的分离 

无菌取送检病死雏鸭心血、肝及脑组织接种于鲜血琼脂平板，于37℃恒温箱培养24小时，挑取可疑菌落作初步形态学鉴定即染色镜检。

1.4.2 培养特性鉴定

 挑取鲜血平板经形态学鉴定的疑似病原菌分别接种于普通琼脂培养基、改良琼脂培养基、血清改良琼脂培养基及鲜血琼脂培养基和普通肉汤、改良肉汤、15%血清改良肉汤中，固体培养基置37℃恒温培养箱静置培养24～48小时，肉汤置振荡培养箱培养24小时。观察并记录。

1.4.3 生化试验

   挑取形态学和培养特性鉴定为疑似RA的鲜血平板菌落传代接种于鲜血平板作纯化增菌,取纯化的菌落无菌接种于微量生化鉴定管,胶布封口,置37℃恒温培养箱置培养过夜。同时，取纯化的菌落接种于血清改良肉汤中置37℃振荡培养箱培养，用于MR、VP及靛基质试验。

1.4.4 动物回归实验

选取4只10日龄健康雏鸭，将鲜血平板纯化菌落洗下作为攻毒菌液，皮下注射0.5mL/只（含菌量1×10⁹cfu/mL），观察并记录结果。病死鸭剖解，无菌取心血划线于鲜血平板培养基培养，观察有否细菌生长及菌落形态特征。

1.5 两种灭活菌苗的制备

1.5.1 增菌与灭活   取鉴定并纯化的RA接种于鲜血平板进行大规模增菌培养，灭菌生理盐水洗涤。按0.5：100体积比加入甲醛溶液置37℃过夜灭活(每隔4～6小时振摇一次)。取少量灭活菌液以麦氏比浊法测定细菌浓度后备用。

1.5.2 疫苗的制备   用灭菌生理盐水将菌液稀释成终浓度为200亿/mL。按比例加入芦荟多糖佐剂，制成含芦荟多糖（以多糖计）5mg/mL、10mg/mL的两种佐剂菌苗，振摇15min后备用。

1.5.3 两种灭活苗无菌及安全性检验   取已经制备好的甲醛灭活菌苗及芦荟多糖佐剂灭活菌苗各1mL，均匀涂布于鲜血平板，37℃恒温培养箱静置过夜，观察有否细菌生长。取18只非免疫10日龄雏鸭，分成两组，分别进行安全性测定。每组接种3个免疫剂量梯度，即0.5mL/只、1mL/只、2mLl/只，每个梯度接种3只鸭，观察10 d。

1.6 两种灭活菌苗免疫效果对比试验

1.6.1免疫接种程序与剂量   按表1进行免疫接种。

表1 两种菌苗免疫接种程序及剂量

Table 1 the inoculation formality and dosage of the two kinds of bacteria vaccines

备注：1、含芦荟多糖5mg/mL；2、含芦荟多糖10mg/mL；3、二免在第一次免疫后的第10天进行。

1.6.2 待检血清的采取与制备

    免疫后第7d，从每组10只鸭中随机选取5只，用一次性注射器按1mL/次采集颈静脉血液。以后每隔3d采血一次直至1个月。采集鲜血转入灭菌5mL离心管（有盖），37℃温箱作用30min，后转入4℃冰箱沉析，取上清液即为待检血清，4℃冰箱保存备用。

1.6.3 抗体的检测   采用试管凝集反应^[6]检测两种灭活菌苗免疫后的抗体升长情况，比较其两种菌苗的免疫效果。

1.6.4攻毒试验  首免后第16d，选择空白对照组、无佐剂菌苗组和高含量芦荟多糖菌苗组试验鸭，以野毒菌株培养物（约6×10⁹CFU/ml）进行攻毒试验，观察其发病与死亡情况。

2.结果与分析

2.1鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定：通过对疑似病原菌形态学观察，该菌呈细小短杆菌，革兰氏阴性，两极略浓染，散在或成群分布；菌落呈边缘整齐的圆形，中央隆突，乳白色或奶油色，鲜血平板菌落呈露滴状，有荧光反应。该菌不在普通琼脂培养基、普通肉汤、改良肉汤、改良琼脂平板生长，能在血清肉汤培养基和血清琼脂培养基及鲜血平板生长，要求营养条件较高。生化特性鉴别试验结果，除蔗糖阳性外，半乳糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、H₂S、果糖、木糖、甘露醇、山梨醇、尿素及MR试验、VP试验、靛基质试验均为阴性，与标准菌株一致。动物回归试验，被接种疑似鸭疫里默氏杆菌病原菌的试验鸭表现出较典型的鸭传染性浆膜炎症状，尤其剖检时肝与心包膜纤维素沉积最为显著。综上表明，该送检病鸭是由鸭疫里默氏杆菌引起的鸭传染性浆膜炎。

2.2 通过无菌检验和安全性检验表明，鸭疫里默氏杆菌芦荟多糖佐剂灭活苗与甲醛灭活苗均未受细菌污染；注射2mL/只雏鸭不表现毒副反应，表明安全性较好。

2.3 两种鸭疫里默氏杆菌灭活菌苗免疫后抗体效价的测定：结果见表2。

表2  两种灭活菌苗免疫后抗体测定结果

Table 2 the specific antibody response to AR in ducks immunized with the two kinds killed bacteria

备注:1.样本数是指随机采取血清样品的每组试验鸭数目；2.抗体滴度是以所测5个样本的平均数；3、采血时间。

卢新华1993^[7]报道，美国1992年将从芦荟中提取的“甘露聚糖”作为免疫增强剂应用于马立克疫苗，可增强肉鸡的免疫应答。国内陆钢等（1995）^【8】研究了芦荟对雏鸡IBD攻毒前后免疫器官的影响，证实芦荟有促进雏鸡免疫器官发育和增重的作用，但将其作为灭活菌苗佐剂在国内尚未见报道。本研究以芦荟多糖作为鸭疫里默氏杆菌灭活菌苗佐剂，探讨芦荟多糖作为佐剂的免疫原性和增效作用。结果表明，芦荟多糖能明显增强疫苗的免疫效果，尤其当芦荟多糖为10mg/mL时，RA灭活菌苗产生抗体的时间明显早于5mg/mL剂量灭活菌苗组和未加佐剂菌苗组，且抗体滴度高，维持高滴度的时间较长。未加佐剂的甲醛灭活菌苗具有一定的免疫原性，但产生抗体的时间较晚，滴度较低。

2.4两种鸭疫里默氏杆菌灭活菌苗免疫组攻毒试验结果：首免后第16d，选择空白对照组、甲醛菌苗组和高含量芦荟多糖菌苗组试验鸭，进行攻毒试验，结果见表3。

表3 两种菌苗免疫16d后攻毒试验结果

Table 3 the results of virus attacking test at day 16 post primary immunization of the two bacteria vaccines

表3结果证实，未接种疫苗组鸭全部发病死亡，甲醛菌苗组保护率仅11.1％，而芦荟多糖菌苗组保护率远高于甲醛菌苗组，达到33.3％。攻毒试验保护率不高，原因可能有二：一是攻毒时间可能不合适，由于灭活菌苗产生特异性保护抗体较慢，攻毒时的抗体滴度较低，还不能产生很好的保护作用；二是攻毒用菌量可能过大，加之本菌是新分离的野毒株，致病力较强，用前未做适宜用量的筛选。但从本试验结果仍可以看出，芦荟多糖确有增强疫苗免疫效力的作用。

3.结论

本试验将芦荟多糖作为免疫佐剂，制备芦荟多糖鸭疫里默氏杆菌灭活菌苗，接种3日龄雏鸭（每只0.5mL）。首免后10天进行二免，于首免后7d（以后间隔3d）采血分离血清，采用试管凝集反应监测其抗体升长情况，并于首免后16d进行攻毒试验，比较芦荟多糖佐剂菌苗与未加佐剂的甲醛灭活菌苗的免疫效果。抗体检测结果，芦荟多糖能明显促进灭活菌苗特异性抗体的产生，尤其是高含量（10mg/mL）芦荟多糖组，产生抗体时间明显早于低含量（5mg/mL）组和未加芦荟多糖组，而抗体滴度也明显高于其它组；甲醛灭活菌苗组具有一定免疫原性，但产生抗体的时间晚，滴度亦较低。攻毒试验结果：高含量芦荟多糖组保护率为33.3％，而甲醛菌苗保护率仅11.1％，未注射疫苗组攻毒后全部死亡。试验结果表明，芦荟多糖佐剂灭活菌苗免疫效果明显优于未加芦荟多糖的灭活菌苗，证明芦荟多糖佐剂能够增强灭活菌苗的免疫效果。

4.参考文献：

[1] 郭玉璞，陈德威，范国雄等.畜牧兽医学报[J].1982，13（2）：7-13

[2] 郑腾，李昂，陈枝华.鸭传染性浆膜炎的诊断和防治现状及进展.中国家禽[J]，2002，21：40～42

[3] 程安春，汪铭书.最新鸭病诊断与防治[M].成都：四川大学出版社，1995.8.

[4]  Pathanasophon P..New serotype of Riemerella anatipestifer isolated from ducks in Thai land[J].Avian Pathol,1995,24:：195～199.

[5] 程安春，汪铭书，陈孝跃等.我国鸭疫里默氏杆菌血清型的调查及新血清型的发现和病原特性.中国兽医学报[J]，2003，23（4）：320-323

[6] 张大丙，郭玉璞.我国鸭疫里氏杆菌血清型的鉴定.畜牧兽医学报[J]，1999，30(6)：536-542

[7] 卢新华，用芦荟提取物“甘露聚糖”增强肉鸡的免疫应答.国外畜牧学－猪与禽[J]. 1993.（3）：53～54

[8]  陆钢，边庆华，刘瑞萍. 芦荟蜂胶花粉对雏鸡IBD攻毒前后免疫器官的影响. 中国兽医杂[J].1995（21）9：37～40

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