一株高效褐藻胶降解菌的筛选及其性质的初步研究

王丽娟 展长淑 孙彦粉 王振杰

（山东大学威海分校海洋学院，山东威海 264209）

摘要：从威海近海天然腐烂的海带中分离得到10株褐藻胶降解菌。以海藻酸钠为唯一碳源，通过驯化培养、初筛、复筛得到一株优势菌。本课题对该优势菌的最适生长条件及最适产酶条件进行研究，并对其酶的性质做了初步研究。

关键词：褐藻胶降解菌；筛选；最适生长条件：最适产酶条件：降解酶性质 

    褐藻胶(algin)是褐藻细胞壁的填充物质，是一种由α-D-甘露糖醛酸和β-L-古罗糖醛酸两种单糖组成的线形多糖^[1]。褐藻胶应用广泛，但其相对分子质量较大，导致其溶解度较低，溶液粘性较大，应用受到很大限制。近年来，褐藻胶寡糖生物活性的研究取得了重大进展，如调节植物生长、诱导植物抗病能力、抗肿瘤及抗老年痴呆，以及防治海洋无脊椎动物常见病的功能等^[2]。因而通过各种降解方法制备的褐藻胶寡糖在糖化学、糖生物学、糖工程及糖类药物研究领域具重要的研究价值。目前褐藻胶寡糖的获取方法主要有物理降解法、酸降解法，氧化降解法和酶解法等。其中酶解法是一种条件温和、可控性强和特异性高的生物降解方法，是目前的主要研究方向^[3]。因此褐藻胶降解酶具有重要的开发价值和研究意义。本项目的研究重点在于利用微生物得到降解酶并最终获得寡糖，通过诱导筛选出产酶量高、酶活性强的优势菌株，确定出其最适生长条件和最适产酶条件，并对降解酶的性质做出初步研究。

1．材料与方法

1．1 材料

1．1．1 样品采集

腐烂海带采集于山东省威海市近海

1．1．2培养基成分

初筛培养基（g/L）：海藻酸钠10；硝酸钾1.0；氯化钠15；磷酸氢二钾0.5；硫酸镁0.5；硫酸亚铁 0.01；琼脂15-20；水1000mL

驯化培养基（g/L）：褐藻酸钠；氯化钠15；蛋白胨1.0；磷酸氢二钾1.0；磷酸二氢钾1.0；磷酸氢二钠1.0；硫酸镁0.5；硫酸亚铁0.01；水1000mL

复筛及发酵培养基（g/L）：褐藻酸钠10;硫酸铵 5.0;磷酸氢钾2.0;氯化钠l5；硫酸镁1.0；硫酸亚铁0.01；酵母膏 1.0;水1000mL

保藏培养基（g/L）：牛肉膏5.0 ；蛋白胨10 ；磷酸氢二钠 2；氯化钠5;琼脂5-7;水1000ml；PH7.4-7.6

1．2 实验方法

1．2．1 菌株的驯化

用海水浸泡天然腐烂海带，制备菌悬液，取1ml菌悬液移入到30ml含海藻酸钠2g/L的驯化培养基中，同时观察培养液的变化，3天后，取1ml驯化液至新鲜驯化培养基中，海藻酸钠浓度按4、6、8、10g/L逐步提高，共驯化5代。

1．2．2 菌种的分离

取第5代培养液适当稀释后涂布于牛肉膏蛋白胨培养基平板上。30℃培养72小时。待菌落长好，挑取不同形态特征的菌落，划线分离直至得到纯化的单菌落。

1．2．3 菌种的初筛

将分离得到的单菌落接于初筛平板上，置30℃培养72小时后，选取在平板上生长的菌株，接种到斜面4℃冰箱保藏备用。

1．2．4 菌种的复筛

1．2．4．1制备液体菌株

将30ml发酵培养基装入100ml三角烧瓶中，于121.5℃灭菌。挑取一环新鲜的初筛菌株斜面种子，于28℃摇瓶培养48小时。

1．2．4．2

在100ml三角烧瓶中装入发酵培养基50ml按2%（体积分数）的接种量接入液体菌种，28℃摇瓶培养72小时后测定发酵培养基中生物量,并用3，5-二硝基水杨酸法酶活。对菌体用细胞破碎仪进行破壁后再测酶活。

1．2．4．3寡糖含量与生物量的测定

生物量的测定：用721型分光光度计为620nm处测定发酵液的吸光度值，以空白发酵培养基作对照。

寡糖含量的测定：本实验采用两种方法测定寡糖含量。第一，可用3，5-二硝基水杨酸法测定酶解产物中还原糖的含量。反应体系溶液包括，1.0ml 1%海藻酸钠溶液，4ml 0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液和1ml发酵液，于40℃恒温水浴30分钟，取出后立即于沸水浴中煮沸15分钟，使酶失活，得糖化液，取糖化液.0ml加入3，5-二硝基水杨酸显色剂2.5ml，在沸水中水浴15分钟，冷却后稀释至25ml摇匀，以1.0ml煮沸失活的发酵液代替发酵液或空白，于550nm处比色^[4]。

第二，将发酵液用高速离心机于8000r/min离心20分钟，取上清液，用752型分光光度计于235nm处直接测定吸光度值以确定寡糖含量。

1．2．4．4优势菌种测定

确定对褐藻酸钠有较好降解能力的菌株作为降解优势菌。

1．2．5优势菌最适生长条件确定

以海藻酸钠为唯一碳源，分别将优势菌置于不同的海藻酸钠浓度，温度，盐度，培养时间等条件下培养，测其生物量和寡糖含量。每组实验重复3次，取其平均值，并确定菌种最适生长条件。

1．2．6降解酶性质的初步研究

用800mL培养基，2%接种量发酵增殖优势菌种，48h后，将发酵液4℃下 8000r/min离心20分钟，弃去沉淀，上清液75%硫酸铵盐析过夜。盐析后，5000r/min离心后弃去上清液，将沉淀重溶于300mL蒸馏水，即为粗酶液。每一试管中加入2mL粗酶液和10mL1测定粗酶液的温度、PH、底物浓度等最适反应条件。

2.结果与讨论

2．1海藻酸钠高效降解菌株的筛选

将从近海取得的腐烂海带制备菌悬液，进行驯化后，利用稀释涂布平板法进行分离及以海藻酸钠为唯一碳源的初筛培养基平板进行筛选，初筛出10株可利用海藻酸钠的菌株，其菌落形态见表1。

表1  10株分离菌株的菌落形态

再通过测定生物量和寡糖含量来检测该株菌降解海藻酸钠的能力。结果经平板分离后得到10株菌可在以海藻酸钠为唯一碳源的培养基上生长，而10号菌株的酶活力明显比其他菌株强，亦即该菌对海藻酸钠有较强的降解能力。因此，本研究选定10号菌株作为海藻酸钠高效降解菌。 

2．2 优势菌最适生长条件的确定

2．2．1 培养时间

  通过发酵培养测定培养天数对该菌生长的影响。

2．2．2  海藻酸钠浓度

    以不同浓度的海藻酸钠配制培养基，测定不同浓度的海藻酸钠浓度对该菌生长情况和分解产生寡糖的影响。

菌液离心后235nm处测吸光度，以测定培养集中的寡糖含量。

褐藻酸钠浓度为10g/L时菌种产酶量最大，随后，随着褐藻酸钠浓度的增大，产酶量逐渐降低。即该菌种的最适产酶褐藻酸钠浓度为10g/L。

2.2．3 NaCl浓度

测定不同NaCl浓度对该菌生长情况和分解产生寡糖的影响。

稀释十倍后于620nm测菌液吸光度。由结果可知，NaCl浓度为20g/L时生物量达最大，该菌生长最好。NaCl浓度过高或过低均不利于该菌生长。在即该菌种的最适生长盐度为20g/L。

离心后235nm测吸光度。NaCl浓度为15g/L时吸光度值达最大，即产酶量最大。最适产酶盐度为15g/L。

2．2．4培养温度

    将该菌至于不同的温度下进行培养，测定温度对该菌株生长的影响。将分离得到的优势菌种分别于20℃，25℃，30℃，37℃条件下培养，2天后分别于620nm处测菌液生物量，菌液离心后于235nm处测寡糖含量。将菌液稀释十倍后的生物量测定结果，菌液离心后于235nm处测寡糖含量结果。由上述两图可知该菌的最适生长温度为28℃左右，最适产酶温度为30℃。温度过高或过低均不利于菌的生长和产酶。

2.3降解酶性质的研究

发酵增殖优势菌种并提取粗酶液，通过在不同的温度、PH及底物浓度下的反应，稀释十倍后，测定其235nm处吸光度值确定最适产寡糖条件，进而确定最适酶反应条件。

2.3.1底物浓度对酶活的影响

每一试管中加入2mL粗酶液和10mL浓度分别为0.2%，0.6%，1.0%，1.4%，1.8%，2.2%的海藻酸钠水溶液，反应20分钟后，加热使酶失活，测定235nm处吸光度。

酶的最使反应底物浓度为1.8g/L。之后随着底物浓度的增加酶活性基本不再增加。

2.3.2 pH对酶活的影响

每一试管中加入2mL粗酶液和10mL浓度分别为1%的海藻酸钠水溶液，至于不同的pH条件下，反应20分钟后，加热使酶失活，测定235nm处吸光度。

酶的最使反应pH为7.2。pH过高或过低都会对酶活性产生影响,使酶活降低。

2.3.3温度对酶活的影响

每一试管中加入2mL粗酶液和10mL浓度为1%海藻酸钠水溶液，置于不同温度条件下，反应20分钟后，加热使酶失活，测定235nm处吸光度。

酶的最使适应温度为35℃。在一定范围内，随着温度的升高酶活性逐渐增高，至35℃时随着温度的升高酶活性开始降低。

讨论

   本实验筛选出10株降解褐藻胶的菌株并通过比较确定了酶活性最高的优势菌株。并确定了其最适生长条件和最适产酶条件并对其酶的性质作出初步研究。该实验表明低温条件下该菌生长和产酶能力都比较低，说明该菌自然条件下对海带的致病力不是很强，但该菌具有良好的体外降解褐藻胶的能力。

    该菌的分类及其生理生化性质尚不明确，所产酶的结构性质和结构机理也不十分清楚，有待近一步研究。

参考文献：

[1]宋凯,于文功，韩峰，等.海洋弧菌褐藻胶裂解酶的分离纯化及性质[J].生物化学与生物物理学报.2003，35（5）：473-477

[2] 刘斌，王长云，张洪荣，等.海藻多糖褐藻胶生物活性及其应用研究新进展[J].中国海洋药物杂志.2004，23（6）：36-41

[3] 杨钊,范莹.不同降解方法制备褐藻胶甘露糖醛酸寡糖的结构特点.中国生化药物杂.2007，28（1）：69-71

[4] 袁兆慧,韩丽君,林伟,等.褐藻酸降解酶的制备及其性质研究[J].海洋科学.2005，29（2）：78-80

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