几种因素对噬菌体侵染大肠杆菌的影响研究

摘要：通过利用λ噬菌体对大肠杆菌烈性侵染特性，研究了宿主生理状态、pH、宿主数量、金属离子及表面活性剂等外界因素对侵染过程的影响，结果表明：宿主生理状态最为重要，指数分裂期的宿主细胞最易受到侵染；pH6～8的中性条件下有利于噬菌体吸附增殖； 100mg/L钙、镁离子能够促进吸附侵染过程；100mg/L铁离子和0.2%吐温80能够抑制吸附侵染过程。

关键词：噬菌体； 大肠杆菌 ； 宿主；侵染

噬菌体（Bacteriophage）是一类专性寄生的原核生物病毒，分布广泛于土壤、空气、水中或生物体内。根据噬菌体与宿主细胞的关系可分为烈性噬菌体（virulent phage）和温和噬菌体（temperate phage）两大类^[1]。噬菌体对发酵工业危害巨大^{[ 2-4]}，本文以λ噬菌体为模式病毒，研究几种外界因素对噬菌体侵染宿主规律的影响。

1  材料和方法

1.1.   材料

1.1.1  菌种： E.colik₁₂Sgal^-（简称负菌）、E.colik₁₂F₂gal^-/λgal⁺/λ（简称正菌）

1.1.2　培养基及缓冲溶液

液体肉汤培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%，氯化钠0.5%，pH7.2

上层半固体培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%，氯化钠0.5%，琼脂0.6 %，pH7.2

下层固体培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%，氯化钠0.5%，琼脂1.8%，pH7.2

加镁磷酸缓冲液：KH₂PO₄ 2g ,K₂HPO₄ 7g ,MgSO₄.7H₂O 0.25g ,蒸馏水1000mL

1.2.   方法

1.2.1  λ噬菌体裂解液的制备^[5]

     液体肉汤培养基将正菌活化18h，离心收集菌体，缓冲液洗涤，紫外线照射10s～15s，黑暗培养3h，加入0.4mL氯仿剧烈振荡30s～60s，静止5min。离心（4000r/min）15min,上清液分别移入试管中,此液即为λ噬菌体裂解液。再次侵染负菌得到噬菌体富集液。

_________________

1.2.2噬菌体效价的测定

采用双层平板法，将下层固体培养基倒平板凝固为底层平板，液体肉汤培养液将噬菌体裂解液10倍稀释至10^-7，5mL融化的上层半固体培养基冷却至45℃左右，分别加入0.5mL负菌敏感菌液，同时加入0.2mL不同稀释度的噬菌体裂解液，迅速倾于底层平板上，轻轻摇匀，待凝固后，置37℃培养24h。统计平板上形成的噬菌斑数量，并计算其效价（噬菌体个数/ml）。

2 结果与分析

正菌菌株是整合λ噬菌体的溶源性大肠杆菌，负菌菌株的λ噬菌体整合能力缺失，因此正菌菌株经紫外线诱导后裂解的λ噬菌体，对负菌菌株则表现为烈性噬菌体的侵染效果。

2.1 紫外诱导大肠杆菌正菌裂解噬菌体的效价

经紫外诱变，正菌被裂解形成的噬菌体裂解液效价为： 2.743×10⁷个/mL

经负菌扩增得到的噬菌体富集液的效价为：1.097×10⁹ 个/mL 

2.2大肠杆菌的生理状态对噬菌体侵染的影响

噬菌体在固体平板上侵染宿主能够形成基本固定大小的噬菌斑，一般12h左右噬菌斑直径大小不再扩展，说明噬菌体对宿主的侵染是有限制的，这种限制是否与大肠杆菌的生理状态有关？将大肠杆菌负菌接种于液体肉汤培养基中，并等分到8个三角瓶中，37℃摇瓶培养，并每隔2h，取出一瓶接入稀释的噬菌体，,同时无菌培养基接入噬菌体为对照，继续培养到30h，分别稀释后双层平板法观察噬菌体数量，结果见表1。

 以对照的噬菌斑结果为阴性结果，则表1显示出前12h噬菌体能够良好侵染宿主，而这个时期正是宿主的快速分裂期，12h后宿主进入稳定期，侵染力也随之丧失，充分说明了噬菌体对宿主的侵染与宿主的生理状态有关，这与固体平板上噬菌斑长到一定大小时不在扩展的结果是一致的。

表1  生理状态对噬菌体侵染的影响

注：+++代表噬菌斑数大于300，

2.2 pH对噬菌体侵染的影响

配制不同pH的上层半固体肉汤培养基， 45℃水浴保温，分别加入0.5mL的敏感菌液，同时加入0.2mL的噬菌体稀释裂解液，摇匀后，双层平板观察噬菌斑生长情况。

表2 pH对噬菌体侵染的影响

注：+++代表噬菌斑数大于300  ++代表噬菌斑数大于200  –代表无噬菌斑生成

表3结果表明pH6.0～8.0时，大肠杆菌生长良好，同时也适合λ噬菌体的侵染。

2.3 敏感菌的数量对噬菌体侵染造成的影响

取6支已灭好菌的半固体肉汤培养基，分别加入0.1mL、0.2mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL的敏感菌液，同时迅速加入稀释的0.2mL的噬菌体裂解液，摇匀迅速倾于底层为肉汤固体培养基平板上，轻轻摇匀，待凝固后，置37℃培养24h。

表3  敏感菌的数量对噬菌体侵染的影响

注：+++代表噬菌斑数大于300

由表3可知，不同量的敏感菌液对噬菌斑数量没有明显影响。

2.4 金属离子浓度对噬菌体侵染造成的影响

在上层半固体培养基中分别加入不同浓度的不同金属离子，再接入稀释的噬菌体和宿主，观察噬菌斑数量，以无离子为对照。

表4  金属离子浓度对噬菌体侵染的影响

注：+代表噬菌斑数小于200  ++代表噬菌斑数大于200  +++代表噬菌斑数大于300

由表4可知，100mg/L的Ca²⁺ 、Mg²⁺能够促进噬菌斑的生成，而100mg/L的Fe²⁺则减少了噬菌斑生成，表明Ca²⁺ 、Mg²能够促进噬菌体对宿主的吸附，而Fe²⁺则抑制噬菌体对宿主的吸附，而其他的金属离子K⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺等则对噬菌体吸附没有明显的作用。

2.5  表面活性剂（吐温80）对噬菌体侵染造成的影响

半固体肉汤培养基中，加入0.2%的吐温80，同时加敏感菌液和噬菌体裂解稀释液，摇匀并迅速倾于底层培养基平板上，轻轻摇匀，待凝固后，置37℃培养24h，观察噬菌斑生长情况。

表 活性剂（吐温80）对噬菌体侵染的影响

注：+代表噬菌斑数小于200  ++代表噬菌斑数大于200

由表5可知，加入吐温80后，噬菌斑减少，由于吐温80是表面活性剂，因此主要作用应该是减少了噬菌体对细菌细胞膜的吸附作用。

3 结  论

平板培养基上的噬菌斑长到一定程度，就不再继续扩大，表明噬菌体对敏感菌株的侵染受到了一定的限制。研究了宿主的生理状态、环境pH、敏感菌数量、金属离子浓度、表面活性剂等因素对噬菌体侵染大肠杆菌的影响，得出结论如下：（1）噬菌体侵染宿主时，宿主的生理状态最为重要，处于指数分裂期的大肠杆菌更易被噬菌体侵染；（2）在pH6～8的中性条件下有利于噬菌体吸附增殖，而在过酸和过碱的情况下不易增殖；（3）一定条件下，敏感菌的数量对噬菌体的侵染影响不大；（4）较高浓度（100mg/L）的Ca²⁺、Mg²⁺对噬菌体的吸附增殖有促进作用；而同浓度的Fe²⁺对噬菌体的吸附增殖有阻碍作用，（5）0.2%表面活化剂吐温80可以破坏敏感菌的细胞膜，从而影响了噬菌体的吸附增殖。 该结论可能为降低发酵工业中噬菌体感染提供了一定的思路。

 参考文献:

[1] 周德庆.微生物学教程[M]，北京：高等教育出版社，2002：63-81

[2] 钟继才.危害乳业的噬菌体的预防对策[J] .中国乳品工业，2006, 34( 7)：61-62

[3] 陈树勋,吴建梅.红霉素链霉菌抗噬菌体菌株的选育[J].现代食品与药品杂志，2006, 16(2)：83-85

[4] 刘琼, 赖滨霞,廖付荣.卡那霉素抗噬菌体生产菌株的选育及应用[J] .福建畜牧兽医 2004, 26(2)：3-4

[5] 杜连祥.工业微生物学学实验技术[M]，天津：天津科学技术出版社，1992：207-209

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