四．微生物的营养

 

1．水分：水占细胞浆的70%～90%，是细胞的重要组成成分。较普遍的观点认为：只有在含水的环境中微生物才能存活。但也有人发现在无水碳氢化合物中微生物可长期存活。

2．碳源：碳源是构成细胞的重要物质。有些微生物的碳源必须来自有机碳化合物如糖、蛋白质、脂肪、有机酸等（同时利用其化学能），属异养型；有些微生物不需有机碳化合物，以CO₂为碳源，属自养型（分为光能自养型和化能自养型）。

3．氮源：氮是组成蛋白质和核酸的重要元素。

4．无机盐类：细菌所需无机盐包括磷、硫、镁、铁、钾、钠、钙、氯、锰、锌、钴、铜等。其中磷、硫、镁、钾、钠、铁需要量较多，其他只需微量。

5．生长因子：生长因子是某些微生物生长发育所必需，而其自身又不能合成的一类营养物质。包括维生素、嘌呤和嘧啶等。

 

五．微生物生长的影响因素

 

1．营养物

2．pH值：各种微生物都有其最适宜的pH值，大多数细菌最适pH为6.8~7.4，但一般有较大的容忍度，在4~9也可存活和生长，少数细菌能在极端pH值范围内生长。真菌适于pH值3~6的微酸性环境，但在2~10也可生长。

3．温度：微生物适于生长繁殖要有适宜的温度，当超过其最低或最高可耐受的温度时，即停止生长或死亡。一般细菌最适温度为30~40℃，真菌为20~30℃。

4．氧气：大多数细菌和所有霉菌都是需氧菌（在有氧环境中才能生长），少数细菌是厌氧菌（在无氧环境中才能生长），有些细菌和酵母菌是兼性需氧厌氧的，在有氧或无氧环境中都能生长繁殖。

5．渗透压：微生物细胞膜和所有生物膜一样是一种半透膜，可让水自由通过，对溶质则有选择性。由于细胞壁的保护，微生物能存活在低渗透压的水中。而在高渗溶液（如高浓度的盐溶液或糖溶液、40%甘油）中，细胞会脱水并停止生长繁殖。但也有一些专性耐高盐细菌只有在高盐（10~15%）条件下才生长。

6．表面张力：表面活性剂可降低表面张力，它是影响细菌生长的因素之一。很多革兰氏阴性菌，特别是大肠菌群可很好地在表面活性剂包围的介质中生长，而大多数革兰氏阳性菌在表面张力低时（0.05N/m）不能很好生长。阳离子表面活性剂对很多有机体有毒性，阴离子表面活性剂毒性很小，非离子表面活性剂几乎没有毒性，并可成为某些微生物的营养物。

 

六．消毒与灭菌

 

消毒与灭菌是微生物实验技术中最基本的操作，从事药品生产和检验的人员都应当了解消毒与灭菌的方法及其意义，严格遵守操作规程，否则会影响产品质量，危害患者安全。

1．概念

Ø无菌——不存在活的生物（GMP指南）。

“无菌”从定义上来说是一个绝对的概念，但遗憾的是，在科学和技术高度发展的今天，药品的绝对无菌即做不到，也无法加以证实。然而，无菌制剂的安全性要求人们设定无菌的相对标准。

FDA、欧洲制药工业界曾将百万分之一微生物污染率作为灭菌产品“无菌”的相对标准，它和蒸汽灭菌后产品中微生物存活的概率为10^-6（即产品的无菌保证值为6），系同一标准的不同表示法。这一标准于1980起收录于USP XX中，如今已为世界各国普遍接受和采用。

Ø灭菌——使达到无菌状态的方法（GMP指南）。用物理或化学方法杀灭传播媒介上所有的微生物，使其达到无菌（GB）。通常是指杀灭或除去全部活的微生物（包括繁殖体和芽孢）。

Ø消毒——用物理或化学方法杀灭或清除传播媒介上的病原微生物，使其达到无害化（GB）。通常是指杀死病原微生物的繁殖体，但不能破坏其芽孢。所以消毒是不彻底的，不能代替灭菌。

Ø无菌制剂——不存在活的微生物的制剂（GMP指南）。

Ø非无菌制剂——所含活的微生物量符合卫生学标准的制剂（GMP指南）。

2．常用消毒剂

 

3．常用灭菌法

1）干热灭菌法　常见的有火焰、烧灼、干烤和红外线灭菌等。

①火焰、烧灼：通常用于实验室无菌操作中金属或其它耐火材料制成的器具的灭菌。

②干烤和红外线：利用干热空气或热辐射进行灭菌。一般135~145℃需3~5h，160~170℃需2h以上，170~180℃需1h以上，180~200℃需0.5~1h。除热原则需250℃30min，或200℃45min，180℃2h。

空气传热慢，穿透力不强，故干热灭菌时间长。干热灭菌时烤箱内装入物品应留有空隙，以利空气流动，否则使箱内温度不均，部分物品灭菌不彻底。

2）湿热灭菌法　通过热蒸汽或沸水使蛋白质变性而杀灭微生物的方法。湿热穿透力强，灭菌效果较干热好。

①煮沸或流通蒸汽灭菌：常压下沸水和蒸汽的温度是100℃，一般处理30~60min可杀死细菌繁殖体，但不能完全杀灭芽孢。此法适用于不能高压蒸汽灭菌的物品。

②低温间隙灭菌（巴斯德灭菌法）：将物品先用60~80℃加热（或煮沸）1h，然后置20~25℃保存24h（或常温过夜），使其中残存的芽孢萌发成繁殖体，再用以上条件灭菌，如此反复三次。本法适用于不耐高温或高温下易变质的物品，但很费时。

③高压蒸汽灭菌（热压灭菌法）：超过一个大气压时，水的沸点高于100℃，反之亦然。高压蒸汽灭菌就是通过加压提高蒸汽温度，灭菌效果最好。它简便、经济、可靠、无毒，是最可靠、应用最广泛的灭菌法。此法适用于耐高温和潮湿的物品。常用条件为：

115.5℃         30min

121.5℃         20min

126.5℃         15min

注意事项：

a. 必须完全排出灭菌器内的空气。否则会影响灭菌器内温度达到规定的要求。

b. 注意被灭菌物品的温度。灭菌器内温度与被灭菌物品的温度一般是一致的，但在蒸汽输入过快时，后者可能低于前者，所以升温时要有一定的预热时间。另外，降温过快易引起玻璃炸裂。因此，对于一种灭菌产品，应制定一固定的灭菌曲线（象冻干曲线一样）。

c. 定期检查灭菌器内温度的准确性。

3）化学灭菌法　利用化学试剂形成的气体来杀灭微生物的方法。常用的灭菌剂为环氧乙烷（又称氧化乙烯）。环氧乙烷是广谱杀菌剂，能杀灭细菌、芽孢和多种病毒，还能杀死昆虫及虫卵。但由于环氧乙烷易燃易爆且有毒（有致变异性），用于药品方面极有限，多用于医疗器械、塑料制品等灭菌。（不能用于橡胶和乳胶手套，能将其溶解。）

4）滤过除菌法　利用细菌不能通过致密具孔滤材的原理，除去对热不稳定的药品溶液或液体物质中的细菌的方法。过滤法一般只能除菌，不能除去支原体和病毒。

过滤除菌的效果与滤膜的性能、孔径的大小、密度、滤膜的厚度等因素有关。

滤过除菌法要求最终过滤的滤膜孔径为0.22μm。由于各厂家生产的相同规格的滤膜质量并不一致，为了保证除菌效果，在使用前后应检查滤器的完好性（如压力维持试验或起泡点试验）。

一个过滤器的使用时间应根据品种验证后确定，一般不应超过8小时。

5）辐射灭菌法　辐射有两种类型：一种是电磁波辐射，如紫外线、红外线、微波；一种是电离辐射，如可引起被照射物电离的X射线、γ射线。

①紫外线：紫外光波长在136~390nm之间，其中260nm左右能破坏核酸，杀菌作用最强。另外，空气中的氧受紫外线照射后，可微量转变为臭氧共同起杀菌作用。紫外线消毒的效果与光源的功率、光源与被照射物的距离、照射时间、温度和湿度等因素有关。我国规定紫外灯照射强度在距离1m处不低于70μW/cm²（以紫外线测强仪测定）。在操作面上要求强度达40μW/cm²以上。一般每10m²装30W灯管1支，工作前开30~60min。

紫外灯的输出功率随使用时间增加而降低。国产紫外灯的平均寿命（点到70%额定功率的时间）一般为2000h，超过平均寿命时，就达不到预期效果，必须更换。

紫外线的穿透力很弱，不能穿透一般包装材料，如玻璃、塑料薄膜、纸等。玻璃能强烈吸收小于350nm的紫外线，石英玻璃能吸收小于200nm的紫外线。因此，它主要用于空气和物体表面消毒，特制的紫外灯装置也可用于水的消毒。

紫外线对眼、皮肤有损坏，照射过程中产生的臭氧对眼、鼻腔有刺激，臭氧过多时使人头晕、胸闷、血压下降。

②红外线：通过加热碳化硅板产生的辐射热能，由空气传导加热灭菌。如红外线烤箱，温度可达180℃左右。热效应特点是由表及里。

③微波：微波灭菌主要是因其热效应。微波加热升温快，温度高且均匀，杀菌作用强。热效应特点是由里及表。不同性质的物品吸收微波的能力不同，其热效应和消毒效果也不同。

微波有一定穿透力，但不强。微波对人体有害，要注意防护。

④⁶⁰Co灭菌：放射性同位素⁶⁰Co（或¹³⁷Cs）衰变时可放射出γ射线，γ射线的能量高、穿透力强，可使细胞内各种活性物质发生化学变化，从而使细菌损伤或死亡。

经⁶⁰Co辐射灭菌的物品温度升高很少，一般仅约5℃，故又称“冷灭菌”。

⁶⁰Co辐射存在两个方面的安全问题：一是辐射的直接作用。γ射线对人体细胞同样有害；二是经过辐射的食品、药品的安全性。1984年美国农业部食品安全实验室用辐射处理的鸡肉喂饲小鼠，发现患睾丸肿瘤增加，包括加重癌病损害。因此⁶⁰Co辐射用于食品和药品都应经过安全试验，进行科学的、全面的评价，高剂量的辐射药品更应慎重。

美国药典规定25kGy为有效灭菌剂量。1997年我国卫生部颁发了⁶⁰Co中药灭菌标准，该标准限国内流通中药可用⁶⁰Co辐照灭菌，规定了允许辐照的药材和中成药的品种和剂量。

中药辐照最大吸收剂量标准：

散剂          3kGy

片剂          3kGy

丸剂          5kGy

中药原料粉    6kGy