（七）硫杆菌的分离培养

硫杆菌属 ，能使硫或硫酐的不完全氧化物转化成硫酸等物质，并参与水中和土壤中硫的循环作用．使土壤和水质改良．当水中积累硫化氢等有毒物质时．可在硫杆菌的作用下转化为无毒物质，利于水产养殖．

硫杆菌在海水、淡水、海泥、池泥及其他土壤中广泛分布。具有代表性的有排硫杆菌、氧化硫杆菌和脱氮硫杆菌等。

1 ．排硫细菌的富集培养与分离

此种细菌能在添加硫化钾或硫代硫酸钠．而无有机碳源的海水中生长．少许有机物也不抑制其生长．但在没有二氧化碳及碳酸盐情况下不能生长。在大量硫化物存在下，硫化物被氧化成硫沉淀于细胞外，此种细菌能氧化硫元素，但较嗜好氧化硫化物、硫代硫酸盐或四硫磺酸盐．氧化不同的硫化物，产物也不同，视作用物的浓度、pH 、En而定．

（1）培养基制备．

Na₂S₂O₃·5H₂O    2 克

K₂HPO4    0.8克

KH₂PO4    0.5克

NH₄Cl    0.08克

MgSO₄    0.16克

FeSO₄    微量

MnSO₄    微量

水    200 毫升

pH  7-7.8

此培养基选择性强，可不必灭菌。其固体培养基用双倍用量加2-3 克琼脂及等量的水制成平板培养基，用紫外线消毒即可。培养基中的微量组分，预先配成稀的水溶液，先滴l 滴在培养皿或锥形瓶中与培养基混匀．

（2）富集培养：将已配制液体培养基分装于4 个150毫升的锥形瓶中，取不同站位的粘海泥或池泥、河泥2-3 克，分别接种于装有培养基的瓶中，每个样品接种2 瓶，振荡均匀。在25-30 ℃ 下培养3-4 天。此后培养液变酸，变浊，一星期内，pH 由7.3 降为3 ．则可估计出培养液中的排硫杆菌繁殖起来已占优势．

（3）分离培养：挑各瓶培养液分别接种于相应编号的平板培养基上，加1 滴无菌水，用曲玻棒涂匀，倒放培养皿于25-30 ℃ 中培养1-2 天，若出现不透明的白色或浅黄色的菌落则继续培养，较大的菌落中央呈橙色小圆点。如不纯，可挑选具有这些特征的菌落作涂板纯化，菌落为圆形，大小约0.2 毫米．全缘，由于有硫粒的积集，内部呈粗粒状结构。

（4）显微观察：呈细短杆菌，大小为0.5×1-3 微米，无孢子，能运动，呈革兰氏阴性反应。

若备有上述各种特点者可初步应定为纯的排硫细菌。

2 ．氧化硫杆菌的富集培养与分离

此种细菌能氧化硫元素为硫酸盐：

① 培养基制备：

硫黄末   2 克

(NH₄)2SO4  0.04 克

KH₂PO₄    0.8克

MgSO₄·2H₂O  0.10克

CaCl₂  0.05克

FeSO₄   微量

水200 毫升

pH 2-3.5

将上述成分溶于水中混匀后，加克分子浓度的磷酸若干，使pH 降至3 左右。由于培养基的酸度高可不需要灭菌,同样用双倍浓度上述成分（也即将水减至100 毫升）加2-3 克琼脂制成平板。

(2）富集培养：按排硫杆菌的培养方法和条件进行．因海泥是微碱性的使pH 提高到5.2 左右，培养2-3 天或更长时间后，培养液出现混浊现象，变酸。一周后pH 由5.2 降至3.7 ，二周后pH 变为2 或更低些，由此可故计这种氧化硫杆菌在培养液中已有大量繁殖。取此培养液少许重复富集培养2-3 次，可获得更大量氧化硫杆菌供分离之用．

（3）分离纯化培养：在已重复富集培养数次的培养液中加硫酸溶液使pH 降至1 或更低些，借此淘汰杂菌，以纯化氧化硫杆菌。

（4）各取少许上述培养液分别在平板培养基上涂板，并按排硫杆菌的培养条件与方法培养l-2 天后观察菌落形态。

（5）显微观察：细短杆菌，大小约为0.5×1.0微米，菌体两端圆形，单一。成双或呈短链排列，无孢子，革兰氏染色阴性反应．运动活泼．

符合上述特征者，所分离的细菌可初步确定为氧化硫杆菌。

3 ．脱氮硫杆菌的富集与分离

（1）培养基制备：

Na₂S₂O₃·5H₂O    1.0克

K₂HPO₄   0.4克

KNO₃      0.4克

NaHCO₃  0.2 克

MgSO₄·7H₂O   0.12克

NH₄Cl  0.1克

FeSO₄·7H₂O    0.002克

水     200毫升

pH    7-7.6

固体培养基用双倍浓度（即将减至100 毫升）加琼脂2-3 克，可用紫外线灭菌。

（2）富集培养：按排硫杆菌的培养方法和条件进行，2-3 天后培养液出现均匀混浊，并有气体从瓶底的沉淀物中陆续上升，由此二种现象可估计培养液中己繁殖不少的脱氮流杆菌，分别将此培养液逐个倾出后，再用新的培养液充满培养瓶，如此重复直至倾入新培养液时，立即见气体从瓶底培养物中逸出，至此可认为培养液中已有足够多的培养菌。

（3）分离纯化培养．按排硫细菌分离方法把培养液分别接种于相应编号的平板培养基上，颠倒平板与焦性没食子酸同时放入干燥器中，抽出空气，充以CO₂，培养1 周左右．观察菌落形态为半透明的圆形小菌落时，取少许菌落重复子平板培养基上作纯化培养。

（4）显微观察：细小杆菌，大小为0.5×1-3 微米，革兰氏染色阴性．无孢子，能运动。

能观察到上述各种特征者，可初步确定为脱氮硫杆菌。

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