（四）海洋固氮菌的分离

绝大多数的水生生物只能利用一定形式的氮化合物，不能区利用游离状态的氮。而固氮菌却能将游离状态的氮变成可供其他生物（如浮游植物）直接利用的化合物—— 氨的形式。同时，水中固氮是海洋和其他水中氮循环的一个重要环节。氨还能被氧化成亚硝酸盐或硝酸盐．水生固氮菌可分为好氧和厌氧两大类。好氧的有褐色球形固氮菌等属革兰氏染色阴性，有鞭毛，常产生象粘液层样的菌落，这些菌落又可分为两种，一种是松散的弥漫的菌胶团；另一种是较紧密的具有可染色的多糖基质细胞。它们的存在数量随着水深而减少，但大量生存于海藻、淡水藻、含硫软泥和含氧量低的海水中。而厌氧性有巴斯德氏固氮梭状芽孢杆菌，属革兰氏染色阳性，周生鞭毛，主要出现于底层水及软泥中。

固氮作用是在固氮酶的催化下将N₂还原成NH₃ ，进而合成有机化合物。在N₂还原中需要6 个电子和电子供体（如丙酮酸）传至l 个具低氧化还原电位（-0.43V ）的电子载体―——铁氧化还原蛋白（Fd ) ，然后经固氮酶的铁蛋白，再传至固氮酶的铁钼蛋白，最终传至N₂。，使之还原成NH₃。

 l ．培养基成分及配制

（1）安息香酸钠（苯甲酸钠）琼脂培养基：

苯甲酸钠l-2 克

CaSO₄·2H₂O  0.1 克

K₂HPO₄   0.2克

MgSO₄·7H₂O   0.2克

NaCl（用于淡水中）0.2克

琼脂18-20克

水1000毫升

pH7.4-7.6

 在112.6 ℃ 的蒸汽灭菌30 分钟后，待冷至45℃ 时倒10个培养皿，每个约倒18 毫升。这种培养基对微嗜氮细菌有抑制作用，却对固氮菌有促进产生黑色素的作用，故对分离纯化有利．

（2）阿什比（Ashby ）无氮琼脂培养基：

甘露醇10.0克

CaSO₄·2H₂O  0.1 克

K₂HPO₄  0.2 克

CaCO₃   5.0 克

MgSO₄·7H₂O 0.2 克

NaCl （用于淡水种）0.2 克

琼脂18-20 克

水1000 毫升

112. 6℃ 的蒸汽下灭菌30 分钟．待冷至45 ℃ 时分装于10个培养皿中，每个18 毫升左右，其中甘露醇可用蔗糖代之．此种培养基能长出微嗜氮细菌，对分离纯化有影响。

2 ．分离步骤

（1）分别用不同的取样器取海水，富含有机质的海底软泥和污沟软泥或污池泥及海藻。

（2）取后三种样品各2 克．分别放入装有5 毫升的无菌水（海中样品用无菌海水）试管中，摇匀成悬浮液。

（3）因样品中固氮菌的数量相对来说不多．故分离前须先做加富培养，即用接种环取上述悬液分别点种于安息香酸钠琼脂平板培养基上，每板可点种9-12 点。每种样品再做一份放于缺氧装置中。

（4）倒置这6 个培养皿于20 ℃ 下，培养5-7天。如在点种的位置有凸起粘稠胶状的半透明菌落长出即可能是固氮菌。

（5）用接种环分别挑取上述6 个平板上的菌落少许．各自在注明相应样品编号的新鲜的安息香酸钠琼脂平板培养基上划线分离。

（6）按此法挑相应菌落在新鲜的阿什比平板培养基上划线分离。每种培养基接种2 份，培养皿应事先编相应代号。

（7）将以上12 个已划线接种的培养皿倒置于20℃ 下培养5-7 天。（原来属缺氧培养的应仍放在缺氧下培养）

（8）挑菌落少许涂片．用革兰氏染色法染色和鞭毛染色法染色．在油镜下观察。

（9）将初步确定的固氮菌菌落移种于斜面培养基上培养，供鉴定研究。

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