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      病毒蛋白亚单位的分离



      录入时间:2009-6-26 9:31:43 来源:青岛龙8

       
      病毒粒子含有几种以上的蛋白质,每一种蛋白质通常都由分子量较小的许多相同的亚单位]组成。病毒的结构蛋白决定着病毒粒子的结构及其与细胞受体部位结合的特异性。病毒的血清学特异性和酶活性也决定于蛋白质。结构蛋白还有保护病毒核酸的作用——核酸处于蛋白外壳的内部,或与蛋白质互相缠绕而成核蛋白。因此病毒基因组受到有关蛋白质的保护,从而可以抵抗理化学因素的降解作用。蛋白质是病毒最主要的组成成份,病毒粒子的蛋白质可以单独地或与糖、脂类]结合在一起,成为糖蛋白或脂蛋白。病毒结构蛋白可以从提纯的病毒制品中通过与核酸和其它蛋白分离,而又不打断肽键的处理方法得到。分离时须用中性去污剂、极性试剂或阻止蛋白聚合的保护剂如尿素、盐酸胍、去氧胆酸钠和SDS等,或改变pH值等方法加以处理。
      下面就几种病毒蛋白亚单位的分离加以介绍:
      1.流感病毒蛋白亚单位分离将提纯的流感病毒悬浮于005mol/L硫酸铵缓冲液中(pH72),加入SDS、尿素、2巯基`乙醇,使其最终浓度分别为2%、05mol/L、004mol/L,在37℃保温30分钟,再于100]℃加热1分钟,然后以含01%SDS、005mol/L尿素的001mol/L磷酸缓冲液(pH72)透析,以]降低SDS的浓度,裂解的病毒亚单位用SDSPAGE制备电泳分离。
      2.猫冠状病毒亚单位分离将提纯的病毒用1%Nonidet]P40(NP40)裂解,然后层加于含有01%NP40,15%到50%]的蔗糖梯度,该梯度于38]500r/min离心17小时,部分(025ml)收集,用2%BSA封闭37℃1小]时,再用亚单位N、E和E2的单抗鉴定,浓缩收集。
      3.辛德毕斯(sindbis)病毒膜蛋白分离大约50mg提纯的辛德毕斯病毒溶于4倍重量的TritonX100,在4℃过夜,样品然后稀释到50ml的PBS中。再过Sephacryl400柱,收集不同的峰,合并浓缩至50ml,将含膜蛋白的]部分浓缩后用PBS透析除去污剂。在没有去污剂的情况下第2次过Sephacryal400柱,再次浓缩收集,SDSPAGE电泳鉴定。
      4.非洲猪瘟病毒蛋白亚单位的分离(1)将提纯的07ml病毒和03ml猪胰脂酶在37℃孵育,对照管加入PBS,消化的前30分钟内,出现大量的衣壳亚单位,而相应部位的病毒粒子减少,表现在内外层衣壳之间的壳粒同时释放出来,当然并不是所有的壳粒都同时释放出来,2小时消化很完全。(2)将脂肪酶消化物经线性梯度离心,35]000r/min2小时,明显出现两条带,上面的这条]带含有壳粒亚单位,收集后检测抗原性及感染性。

       

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