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【原理】
聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺与N , N-次甲基双丙烯酰胺(bis)在催化剂四甲基乙二胺(TEMED)和过硫酸铵作用下聚合而成,通过两者浓度的改变可形成不同孔径的筛孔,聚丙烯酰胺凝胶电泳兼有分子筛和电泳的双重作用,能精细分离蛋白及核酸。十二烷基硫酸钠(SDS)是阴离子去污剂,它与蛋白质的疏水区相结合,可使蛋白呈一致的强负电荷,所以可增加聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨力。
【成分】
(1) A液:30%丙烯酰胺
|
丙烯酰胺 |
30g |
|
N, N-次甲基双丙烯酰胺 |
0.8g |
|
加水至 |
100ml |
|
4℃避光保存 |
|
(2)B液:1.5mol Tris · HCl ,pH8.8。
(3)C液:10%SDS。
(4)D液:0.5mol Tris · HCl ,pH6.8。
(5)四甲基乙二胺(TEMED):原液。
(6)10%过硫酸胺:4℃保存,二星期内使用。
(7)电泳液:
|
Tris |
6g |
|
甘氨酸 |
28.8g |
|
10%SDS |
10ml |
|
加双蒸馏水至 |
1000ml |
|
调至pH8.8 |
|
(8)染色液:
|
0.2%考马斯蓝 |
若干ml |
|
50%甲醇 |
若干ml |
|
7%乙酸 |
若干ml |
(9)脱色液:
|
50%甲醇 |
若干ml |
|
7%乙酸 |
若干ml |
(10)样本缓冲液:
|
0.05mol Tris. HCl ,pH6.8 |
若干ml |
|
0. 1%SDS |
若干ml |
|
10%甘油 |
若干ml |
|
0.1%二巯基乙醇 |
若干ml |
|
0.002%溴酚蓝 |
若干ml |
【制法】
1. 分离胶的配制:见表44—1。
2. 4%的样品胶的配制(100ml):
|
A液 |
13.3ml |
|
B液 |
12.5ml |
|
C液 |
1.0ml |
|
双蒸馏水 |
72.2ml |
|
TEMED |
50μl |
|
10%过硫酸铵 |
1.0μl |
表44—1聚丙烯酰胺凝胶(分离胶)的配制
|
凝胶浓度 |
2.5 |
5 |
7.5 |
10 |
13 |
15 |
20(100ml) |
|
A液(ml) |
8.3 |
16.7 |
25.0 |
33.3 |
43.3 |
50.0 |
66.7 |
|
B液(ml) |
12.5 |
12.5 |
12.5 |
12.5 |
12.5 |
12.5 |
12.5 |
|
C液(ml) |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
|
双蒸馏水(ml) |
78.0 |
69.6 |
61.3 |
53.0 |
43.0 |
36.3 |
19.6 |
|
TEMED (μl) |
50.0 |
50.0 |
50.0 |
50.0 |
50.0 |
50.0 |
50.0 |
|
10%过硫酸铵(ml) |
0.2 |
0.2 |
0.2 |
0.2 |
0.2 |
0.2 |
0.2 |
【用途】
聚丙烯酰胺凝胶电泳用于蛋白质或核酸的纯度、含量和分子量大小的鉴定和分析,也可用于蛋白质、核酸的纯化。其浓度与有效分辨率之间的关系见表44—2。
表44—2丙烯酰胺浓度及其有效分辨范围
|
丙烯酰胺 浓度(%) |
有效分辨范围 |
|
|
核甘酸数 |
蛋白分子量(道尔顿) |
|
|
3.5 |
100~1000 |
|
|
5.0 |
80~500 |
2.5~20.0X104 |
|
8.0 |
60~400 |
|
|
10.0 |
|
1.5~7.0X104 |
|
12.0 |
40~200 |
|
|
15.0 |
|
1.2~4.5X104 |
|
20.0 |
10~100 |
|
【注意事项】
1. 电泳过程中,电压过高,会使凝胶发热。一般以较低电压,较长时间的效果为好。
2. 丙烯酰胺是神经毒物质,可经呼吸道或皮肤进入人体。实验操作时要戴手套,避免用口吸取溶液。
3. 凝胶板在电泳槽中固定后,用丁形玻璃管赶走底部气泡,至为重要。若有气泡,则凝胶中的蛋白或核酸带易产生弯曲。
4. 在进行蛋白凝胶电泳时,必须用已知分子量大小的蛋白作为分子量标记,同时进行电泳。常用的分子量标记为:
|
卵白蛋白 |
43000道尔顿 |
|
α-糜蛋白酶原 |
25700道尔顿 |
|
β-乳球蛋白 |
18400道尔顿 |
|
溶菌酶 |
14300道尔顿 |
|
细胞色素C |
12300道尔顿 |
|
牛胰蛋白酶抑制物 |
6200道尔顿 |
|
胰岛素(A和B链) |
～3000道尔顿 |
(第二军医大学 刘沪丽供稿全章 由第二军医大学 谢正旸审编)
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