1、蛋白胨稀释液的制备:

  将1g蛋白胨(细菌蛋白胨除外)溶于1000ml去离子水中，用盐酸调节pH至7.0，灭菌温度为121℃。时长15分钟。

2、微量元素溶液制备:

  微量元素水溶液营养成分的组成如表1所示

表1.微量元素溶液组成

微量元素	浓度
氯化钠	10mg/ml
七水硫酸亚铁	18mg/ml
一水硫酸锰	16mg/ml
七水硫酸锌	1.6mg/ml
五水硫酸铜	1.6mg/ml
七水硫酸钴	1.6mg/ml

3、液化GYE琼脂培养基的制备:

  营养成分的组成如表2所示

表2.液化GYE琼脂培养基营养成分的组成

试剂	数量
酵母提取物粉末	5.0g
蛋白胨	5.0g
葡萄糖	5.0g
磷酸氢二钾(K2HP04)	0. 5g
磷酸二氢钾(KH2P04)	0. 5g
硫酸镁	0.3g
微量元素	1.0ml
水	1000.0ml

  使用乳酸溶液调节上述营养成分混合液pH到6.3。将混合液转移到大锥形瓶中，向锥形瓶中加入15.0g琼脂。使用铝箔包裹锥形瓶，将其放置于加热板上进行加热，并搅摔，直到琼脂完全溶解。随后在高压灭菌锅中在121℃下进行至少15分钟灭菌。待高压灭菌锅可以安全打开时，将锥形瓶放置于50℃的水浴中。

4、样品准备

  4.1 食品取样

  称取25g样品，置于无菌均质袋中，加225ml灭菌蛋白胨水，拍击式均质器均质至完全溶解于蛋白胨水，混匀。

  注:若样品不能完全溶于蛋白胨水，需要将蛋白胨水预热至50C再加入样品，或加入样品后将混合悬浮液置于50℃预热5min,直至样品完全溶解。

  4.2 检查混合悬浮液pH值。若pH小于7.0，用氢氧化钠(5N)溶液调节pH至8.5±0.2;若pH大于8.7，用盐酸溶液(5N)调节pH至8.5±0.2。

  4.3 样品移取20-30ml均质悬浮液于50ml离心管中于75℃水浴30min,立即冷却至45℃以下，然后移液。

  4.4 移取1.0ml该液于9.0ml灭菌蛋白胨水的试管中，涡旋彻底混匀(10-2稀释管即得)。

  4.5 根据要求重复操作。所做稀释度及平板培养所用稀释度应随预期孢子数变化而变化。

  注1:将每个稀释度溶液混匀，然后移液;

  注2:步骤4.3:将离心管置于水浴后立即开启计时器。

5、平板培养

  5.1 液化GYE琼脂培养基，然后置于水浴中冷却至50℃以下(该培养基容易凝固，要置于50℃左右的水浴锅内) ;每个稀释度准备两个无菌培养皿。分别从最后两个稀释管溶液中加1.0ml于相应编号的培养皿中，然后将15至20ml的熔融培养基倒至各个培养皿，彻底混匀。待固化时，将平板翻转，40℃+2℃培养48小时，同时准备一个只包含琼脂培养基及一个只含有1.0ml蛋白胨稀释液和琼脂培养基作为阴性对照。

6、平板计数

  菌落数在30至300之间的平板计数最为理想。平板计数只记录满足以下条件的菌落:琼脂表面的菌落需要直径为1mm到5mm;白色到奶色，凸面，具有完整的边缘和光滑的表面。嵌在琼脂培养基中的菌落需要直径为0. 5mm-1mm在琼脂中具有奶色的点状体。

  6.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内,计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g(ml)样品中菌落总数结果。

  6.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式(1)计算:

  N= ∑C/ (n1+0.1n2)d........................ (1)

  式中:

  N-样品中菌落数:

  ∑C - 平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和:

  n1 - 第一稀释度(低稀释倍数)平板个数;

  n2 - 第二稀释度(高稀释倍数)平板个数;

  d - 稀释因子(第一稀释度)。

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