一、参考标准：

  《GB4789.29-2020食品安全国家标准 食品微生物学检验 唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）检验》。

二、菌种特征：

  1、生物学特性：

  革兰氏阴性杆菌，长2.5-3μm，宽0.5-1.0μm，呈杆状、球杆状或稍弯曲，两端钝圆，无芽胞，有鞭毛。本菌为兼性厌氧，但易在表面生长。最适生长温度为37℃，最适产毒温度为26℃。pH 5-7范围内生长较好。

  2、流行病学特点：

  椰毒假单胞菌酵米面亚种（Psedomonas cocovenenans subsp.farino fermentans)是我国发现的一种食物中毒菌，为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（Burkholderia gladioli）的一个病原型。它存在于发酵的玉米、糯玉米、黄米、高梁米、变质银耳以及周围环境中，它是酵米面及变质银耳中毒的病原菌。该菌产生的毒素米酵菌酸是其致病原因。该食物中毒的主要症状，开始患者感到上腹部不适，少数出现腹泻、恶心、呕吐，呕吐物多为咖啡色，严重者出现黄疸、昏迷、四肢抽搐、少尿、血尿、便血和尿潴留，呈现休克而死亡。目前尚无特效的治疗办法。

三、培养基原理分析及结果：

  1、改良马铃薯葡萄糖琼脂（mPDA）（点击此查看培养基详情）

  原理：马铃薯为微生物的生长提供各类氮源、碳源、维生素，葡萄糖提供能源，琼脂是培养基的凝固剂，氯霉素可抑制细菌的生长，龙胆紫抑制真菌的生长。

  结果：培养24 h后，菌落1 mm-2 mm，紫色，光滑、湿润、边缘整齐；培养48h后，部分菌落中心可有呈草帽状凸起。如图一。

图一 唐菖蒲伯克霍尔德氏菌ATCC10248培养48h

  2、PCFA培养基（点此查看培养基详情）

  原理：PCFA培养基基础中的氯化铵为微生物的生长提供氮源；磷酸二氢钾和磷酸氢二钠是缓冲剂；氯化钠可维持细胞渗透压；氯化钙、硫酸镁和硫酸亚铁为微生物生长提供微量元素；葡萄糖和胱氨酸用于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌代谢酶的合成；卫矛醇可为微生物生长提供碳源；琼脂是培养基凝固剂。配套添加剂可抑制大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌等革兰氏阴性杆菌生长，同时也可抑制大部分革兰氏阳性球菌的生长。

  结果：培养24 h后，菌落0.5 mm-1 mm，灰白色，光滑、湿润、边缘整齐。如图二。

图二 唐菖蒲伯克霍尔德氏菌ATCC10248培养48h

  3、卵黄琼脂

  原理：蛋白胨和牛肉粉提供碳氮源、维生素和生长因子；葡萄糖提供能源；氯化钠维持均衡的渗透压；琼脂是培养基的凝固剂；具有卵磷脂酶的细菌可分解卵磷脂生成不溶性甘油酯，从而形成乳白色的混浊带。

  结果：培养24 h后，菌落2 mm-3 mm，表面光滑、湿润；培养48 h后，菌落周围形成乳白色混浊环，斜射光下可见菌落及周围培养基表面呈虹彩现象。如图三。

图三 唐菖蒲伯克霍尔德氏菌ATCC10248培养48h

四、生化鉴定原理及结果分析：

  1、革兰氏染色

  试验所用试剂：革兰氏染色液试剂盒。

  原理：革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此，能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。

  结果：革兰氏阴性，菌体呈短杆状，单个或成对排列。如图四所示。

图四

  2、氧化酶试验

  试验所用试剂：氧化酶试纸。

  原理：氧化酶即细胞色素氧化酶，为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，氧化酶先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。在 30s内变为蓝色或蓝紫色为强阳性，2min内不变色为阴性。

  结果：不变色，为阴性。如图五

图五 左：唐菖蒲伯克霍尔德氏菌ATCC10248  右：铜绿假单胞菌ATCC9027

  3、尿素酶试验

  试验所用试剂：尿素酶生化管。

  原理：有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生氨，使培养基变碱呈粉红色。

  结果：培养基变为粉红色，为阳性。如图六。

左：唐菖蒲伯克霍尔德氏菌ATCC10248  右：大肠埃希氏菌ATCC25922

图六

  4、柠檬酸盐利用试验

  试验所用培养基：西蒙氏枸橼酸盐培养基。

  原理：西蒙氏枸橼酸盐培养基中氯化钠维持均衡的渗透压，镁离子是各种代谢中的辅因子，磷酸二氢铵提供氮源，磷酸氢二钾是缓冲剂，柠檬酸钠作为碳源，琼脂是培养基的凝固剂，溴麝香草酚兰为pH 指示剂。当细菌可以利用铵盐作为唯一的氮源，同时利用柠檬酸盐作为唯一的碳源时，可在柠檬酸盐培养基上生长，分解柠檬酸钠，生成碳酸钠，使培养基产碱变蓝色。

  结果：培养基变蓝，为阳性。如图七。

左：大肠埃希氏菌ATCC25922  右：唐菖蒲伯克霍尔德氏菌ATCC10248

图七

  5、石蕊牛奶试验

  试验所用培养基：石蕊牛奶培养基。

  原理：牛奶中含有乳糖以及三种主要的蛋白质，即酪蛋白、乳清蛋白和乳球蛋白。在石蕊牛奶培养基中，微生物可能表现出一种或几种代谢特性，每一种特性专属于特定 菌种，可以辅助细菌的鉴定。这些代谢特性包括乳糖发酵、石蕊还原、凝乳产生、胨化（蛋白消化）和产气。石蕊是良好的酸碱指示剂，自身的氧化还原特性及对细菌的低毒性（相对于溴甲酚紫）使得石蕊成分十分有用的牛奶培养基指示剂。

  结果：顶部淡紫色，底部乳白色。如图八。

左：空白对照  右：唐菖蒲伯克霍尔德氏菌ATCC10248

图八

  6、靛基质试验

  试验所用培养基、试剂：蛋白胨水（色氨酸肉汤）、Kovacs靛基质试剂。

  原理：蛋白胨为微生物的生长提供碳氮源、维生素和生长因子；氯化钠维持均衡的渗透压；含有色氨酸酶的细菌，能分解蛋白胨中的色氨酸，形成靛基质（吲哚），靛基质无色，当加入对氨基苯甲酸试剂后，形成可见的红紫色醌式化合物，即玫瑰靛基质。

  结果：滴加Kovacs靛基质试剂后产生黄色环，为阴性。如图九

左：唐菖蒲伯克霍尔德氏菌ATCC10248  右：大肠埃希氏菌ATCC25922

图九

  注：唐菖蒲伯克霍尔德氏菌其它生化特征见下表。

生化试验	特征
O/F试验（氧化型）	＋
氧化
葡萄糖	＋
果糖	＋
木糖	＋
半乳糖	＋
蔗糖	－
阿拉伯糖	＋
甘露醇	＋
侧金盏花醇	＋
肌醇	＋
卫茅醇	＋
动力	＋
卵磷脂酶	＋
氧化酶	－
尿素	＋
明胶液化	＋
硝酸盐还原	＋
柠檬酸盐利用	＋
精氨酸	＋
石蕊牛乳	＋
靛基质	－
V-P	－
MR	－
苯丙氨酸脱氨酶	－
H2S产生	－
注：＋表示阳性；－表示阴性。

  注：本文属龙8生物原创，未经允许不得转载。

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