1 方法来源
1.1 进出口食品中霍乱弧菌检测方法(SN/T 1022-2010)
1.2 卫生部《霍乱防治手册》第六版(2013年)
2 适用范围
本程序规定了食品中霍乱弧菌（Vibrio cholera）的检验方法。本程序适用于食品中霍乱弧菌的检验。
3 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
3.1 恒温培养箱：36℃±1 ℃。
3.2 恒温培养箱：41.5℃±1℃。
3.3 冰箱：2℃～5℃。
3.4 恒温水浴箱：36℃±1℃。
3.5 均质器或无菌乳钵。
3.6 天平：感量0.1 g。
3.7 无菌试管：18 mm×180mm、15mm×100mm。
3.8 无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。
3.9 无菌锥形瓶：容量250mL、500 mL、1000mL。
3.10 无菌培养皿：直径90mm。
3.11 微生物生化鉴定系统。
3.12 无菌手术剪、镊子。
4 培养基和试剂
4.1 碱性蛋白胨水：见附录A中A.1。
4.2 硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖（TCBS）琼脂：见附录A中A.2。
4.3 4号琼脂：见附录A中A.3。
4.4 庆大霉素琼脂：见附录A中A.4。
4.5 商品化生化鉴定试剂：见附录A中A.5。
5 检验程序
6. 操作步骤
6.1 样品处理
称取25g样品放入盛有225mL碱性蛋白胨水的无菌均质杯中，以8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或置于盛有225mL碱性蛋白胨水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min。如无均质器，则将样品放入无菌乳钵中磨碎，然后放在500mL的灭菌容器内，加225mL碱性蛋白胨水，并充分振荡。
如为冷冻产品,应在45℃以下不超过15 min,或2 ℃～5℃不超过18h解冻。
6.2 一次增菌
将深冻样品、干品、腌渍产品于36℃±1℃培养6h～8h，新鲜样品41.5℃±1℃培养6h～8h（如无明显的细菌生长现象则继续培养，但不能超过20 h）。
6.3 二次增菌
同时吸取上述一次增菌的表层增菌液0.2mL，加入10mL碱性蛋白胨水管中，36℃±1℃培养6 h～8 h。
6.4 分离
6.4.1 在所有显示生长的一、二次增菌管中用接种环沾取一环表层增菌液，分别于TCBS（或科玛嘉弧菌显色培养基）平板、4号琼脂（或庆大霉素琼脂）平板上划线分离。于36℃±1℃培养18 h～24 h。
6.4.2 各种平板上霍乱弧菌的典型菌落特征见表1。
表1 霍乱弧菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征
|
选择性琼脂平板 |
霍乱弧菌 |
|
TCBS |
圆形、边缘半透明而中央不透明、表面光滑的黄色菌落，直径约3 mm左右。 |
|
科玛嘉弧菌显色培养基 |
蓝色，蓝绿色到绿色菌落。 |
|
4号琼脂培养基 |
圆形、半透明、光滑湿润、灰黑色水滴样菌落，直径约3 mm左右。 |
|
庆大霉素琼脂平板 |
略带青灰色、半透明、扁平、微隆起、光滑湿润。如延长培养时间或室温放置到48h， 菌落略带黄色，中心形成黑色金属碲沉淀。 |
6.4.3 纯培养
每个平板上各挑取5个或以上可疑菌落（少于5个全部挑取），接种于营养琼脂斜面（或平板），36℃±1℃培养18h～24h。
6.5 初步鉴定
6.5.1 氧化酶试验
挑选纯培养的单个菌落进行氧化酶试验，霍乱弧菌为阳性。
6.5.2 粘丝试验
挑选纯培养的单个菌落进行粘丝试验，霍乱弧菌为阳性。
6.5.3 涂片镜检
将可疑菌落涂片，进行革兰氏染色，镜检观察形态。霍乱弧菌为革兰氏阴性，呈弧形、逗点状等多形态，无芽胞。
6.5.4 挑取纯培养的单个可疑菌落，转种三糖铁琼脂斜面并穿刺底层，36℃
±1℃培养24 h观察结果。霍乱弧菌在三糖铁琼脂中的反应为底层变黄不变黑，无气泡，斜面颜色变黄。
6.6 确定鉴定
初步鉴定结果相符者用微生物生化鉴定系统或商品化生化鉴定试剂进行系统鉴定。
6.7 血清鉴定分型
6.7.1 血清鉴定
自营养琼脂斜面上挑取纯培养物与O1群及O139群霍乱弧菌诊断血清做玻片凝集试验。玻片凝集用血清的效价一般应为1：40～1：50。如可疑菌落在血清中很快（一般在10 s内）出现肉眼可见的明显凝集，在生理盐水中不凝集者判为阳性。均不凝集方可报告未检出O1群及O139群霍乱弧菌。
6.7.2 O1群霍乱弧菌血清分型
上述确定为O1群霍乱弧菌的培养物，分别使用小川型及稻叶型单价血清做玻片凝集，同时做生理盐水对照。
6.8 报告
当检出的可疑菌落生化学性状符合表1要求，同时与霍乱弧菌诊断血清凝集（生理盐水不凝集），报告25g（mL）样品中检出霍乱弧菌。霍乱弧菌主要性状与其他弧菌的鉴别见表2。
表1 霍乱弧菌的生化性状
|
试验项目 |
结果 |
|
革兰氏染色镜检 |
阴性，无芽胞 |
|
氧化酶 |
＋ |
|
粘丝试验 |
＋ |
|
动力 |
＋ |
|
蔗糖 |
＋ |
|
葡萄糖 |
＋ |
|
分解葡萄糖产气 |
－ |
|
乳糖 |
－/＋ |
|
硫化氢 |
－ |
|
注：＋阳性；－阴性 |
|
表2 霍乱弧菌主要性状与其他弧菌的鉴别
|
名称 |
氧 化 酶 |
赖 氨 酸 |
精 氨 酸 |
鸟 氨 酸 |
明 胶 |
脲 酶 |
V ︱ P |
42 ℃ 生 长 |
蔗 糖 |
D ︱ 纤 维 二 糖 |
乳糖 |
阿 拉 伯 糖 |
D ︱ 甘 露 糖 |
D ︱ 甘 露 醇 |
O N P G |
嗜盐性试验NaCl含量（％） |
||||
|
0 |
3 |
6 |
8 |
1 0 |
||||||||||||||||
|
副溶血性弧菌 |
＋ |
＋ |
－ |
＋ |
＋ |
V |
－ |
＋ |
－ |
V |
－ |
＋ |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
＋ |
＋ |
＋ |
－ |
|
创伤弧菌 |
＋ |
＋ |
－ |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
＋ |
－ |
＋ |
＋ |
－ |
＋ |
V |
＋ |
－ |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
|
溶藻弧菌 |
＋ |
＋ |
－ |
＋ |
＋ |
－ |
＋ |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
－ |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
＋ |
＋ |
＋ |
＋ |
|
霍乱弧菌 |
＋ |
＋ |
－ |
＋ |
＋ |
－ |
V |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
－ |
＋ |
＋ |
＋ |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
－ |
|
拟态弧菌 |
＋ |
＋ |
－ |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
＋ |
－ |
－ |
－ |
－ |
＋ |
＋ |
＋ |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
－ |
|
河弧菌 |
＋ |
－ |
＋ |
－ |
＋ |
－ |
－ |
V |
＋ |
＋ |
－ |
＋ |
＋ |
＋ |
＋ |
－ |
＋ |
＋ |
V |
－ |
|
弗氏弧菌 |
＋ |
－ |
＋ |
－ |
＋ |
－ |
－ |
－ |
＋ |
－ |
－ |
＋ |
＋ |
＋ |
＋ |
－ |
＋ |
＋ |
＋ |
－ |
|
梅氏弧菌 |
－ |
＋ |
＋ |
－ |
＋ |
－ |
＋ |
V |
＋ |
－ |
－ |
－ |
＋ |
＋ |
＋ |
－ |
＋ |
＋ |
V |
－ |
|
霍利斯弧菌 |
＋ |
－ |
－ |
－ |
－ |
－ |
－ |
nd |
－ |
－ |
－ |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
－ |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
|
注：nd表示未试验；V表示可变。 |
||||||||||||||||||||
7. 毒力基因检测
如鉴定结果为霍乱弧菌，需进行ctxAB基因的检测。注意：也可采用经过验证的商品化试剂盒。
7.1 DNA模板的制备
取适量纯培养菌落加入500μL灭菌dH2O中混匀，煮沸10min，15000×g离心3 min。取上清液储存在-20℃直至使用。也可以用商业化的DNA提取试剂盒，按其说明提取制备DNA模板。
7.2 PCR扩增
7.2.1 引物
可使用引物对5'-ATT TTG AGG TGT TCC ATG TG-3'和5'-ATA AAGCAGTCA GGT GGT CT-3'。扩增产物全长749bp。
7.2.2 阴、阳性对照设置
阴性对照(空白对照)以灭菌水作为PCR反应的模板；
阳性对照采用含有检测序列的DNA（或质粒）作为PCR反应的模板。
7.2.3 PCR扩增反应体系
|
试剂 |
反应体积 |
|
dH2O |
12.8 μL |
|
10× Buffer. MgCl2 |
2.0 μL |
|
dNTPs |
0.8 μL |
|
混合引物 |
2.0 μL |
|
模板 |
2.0 μL |
|
Taq 酶 |
0.4 μL |
|
总体积 |
i. μ |
|
|
L |
|
预变性 |
94℃ |
5 min； |
|
变性 |
94℃ |
30 sec， |
|
退火 |
56℃ |
40 sec， |
|
延伸 |
72℃ |
2 min，30个循环； |
|
终延伸 |
72℃ |
7 min； |
|
保存 |
8℃ |
—— |
7.2.5 电泳
用0.5.5c序制备1.5％的琼脂糖凝胶（含EB或Goldview 0.5μg /mL）。取5μL产物点样（可包括适量上样缓冲液），用DNA分子量标记物做参照，电压100 V，电泳50 min（根据实验室仪器情况确定具体电泳条件）。使用凝胶成像系统对电泳结果进行保存和分析。
7.3 结果判定
阴性对照未出现条带，阳性对照出现预期大小的扩增条带条件下，如待测样品出现749 bp大小的扩增条带，则可判定该菌株携带ctxAB基因；未出现749bp大小的扩增条带，则可判定不携带ctxAB基因。
如果阴性对照出现条带和/或阳性对照未出现预期大小的扩增条带，本次待测样品的结果无效，应重新进行试验，并排除污染因素。
